보건환경미생물학실험 | Isolation and electrophoresis of the chromosomal DNA
보통 E. Coli에서 염색체 DNA를 분리해 내 전기 영동하여, 종을 구별하거나 DNA를 확인할 때 쓸 수가 있다. 본 실험은 어떤 sample이 PCR이 잘 되어 증폭된 DNA로서, DNA band를 구성할 지 확인하고, 그 sample을 이용하기 위함이다.
1. Chromosmomal DNA
원핵생물에 있어서는 genomic DNA에 속한다. 원핵생물의 염색체를 말하며, haploid circular DNA다. 그리고 대부분은 sing chromosome으로 구성되어 있고, 일부는 2개의 염색체로 되어 있다.
2. Lysozyme
Fleming이 발견한 가수분해효소로서, 원핵생물의 N-아세틸무람산과 N-아세틸글루코사민 사이의 β-1,4 글루코시드결합을 가수분해한다. 대장균에서 plasmid를 추출할 때 세포벽 용해를 위해 쓴다.
실험 방법
1. 전기 영동
1) agarose gel(0.8%v/v)을 만든다.
① 0.5× TBE Buffer 100㎖
② agarose 0.8g
③ agarose 가루를 넣고 끓이며, 가루가 완전히 녹아 맑은 상태가 되도록 한다.
2) 끓여서 녹인 아가로스 젤 용액을 50～60℃가 되도록 식힌 다음 기포가 생기지 않도록 천천히 gel 판에 붓고 comb를 꽂아서 샘플 홈을 만든다.
3) 약 30～40분 후에 gel이 굳으면 comb를 빼내고 만들어진 gel을 빼내어 전기영동 장치 속에 놓고 완충용액이 gel을 충분히 덮도록 위로 약 2～3mm까지 붓는다.
4) comb의 홈으로 PCR을 해서 DNA가 증폭된 용액을 넣는다.
5) 전기영동을 20～30분동안 가동한다.
6) EtBr로 염색을 15분간 동안 한다.
7) UV transmitter로 관찰하고, 사진을 찍는다.
2. Isolation (Clean-Up)
1) Buffer PB와 PCR해서 만든 sample을 각각 5:1로 SV column에 넣고 혼합한다.
2) 30초 동안 원심분리 후에, 필터에 통과된 것을 버리고, 다시 같은 tube에 SV column를 넣어 삽입한다.
3) Buffer NW를 700㎕ 넣고 30초동안 원심분리한 뒤, 여과된 것을 버리고, 다시 collection tube에 SV colun을 넣어 삽입한다.
4) 잔여의 Wash Buffer를 제거하기 위해 1분씩 1.～3. 항목을 추가적으로 원심분리하고, 새로운 15ml tube에 SV column을 옮긴다.
5) Buffer EB 50㎕를 SV column 안의 중심에 넣고, 1분동안 기다린다.