보건환경미생물학실험 | Heterologous expression of the transformed gene

 

 

 

TIP

 

 

형질전환된 미생물에서 plasmid에 의해 이형발현시켜, 생성된 단백질로 형질전환이 잘 되었는지 확인하고, 어떤 과정에서 잘못되었는지 점검하고자 한다.

 

 

 

IPTG induction

isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside의 약칭으로, lac operon 효소합성을 유도하는 강력한 유발물질이다. 비분해 비대사성이 유도물질이라 미생물이 합성을 계속 유도시킨다. lacZ gene에서 β-galactosidase 만들 때 필요하다. allolactose와 유사한 젖당유사체로서, inhibitor(repressor)와 결합하여, E. coli의 RNApolymerase가 lac promoter를 인식하도록 하여, T7 polymerase gene을 전사하도록 하는 역할을 담당한다.

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실험 방법

1. TSS transformation and expression

1) 대장균을 액체배지에 접종하여 37℃에 overnight heating을 해준다.

 

2) 50배 희석하여 3～4시간동안 생장배지(LB 3㎖+DH3α 30㎕)에서 배양한다.

 

3) 튜브에 각각 E. coli DH5α 1.5㎖씩 넣고 원심분리(14000rpm)에서 3분 돌린다.

 

4) 상층액을 제거하고 pellet만 남긴다.

 

5) TSS용액 196㎕와 MgCl₂, MgSO₄ 4㎕를 각 튜브에 넣고 pellet과 resuspension을 해준다.

 

6) 얼음에 잠시 보관(1min)한다.

 

7) DNA ligation한 sample을 튜브에 2㎕씩 넣는다.

 

8) 얼음에 30분간 보관한다.

 

9) 원심분리(14000rpm)를 3분하고 상층액 제거하고 pellet만 남긴다.

 

10) pellet에 LB 1㎖ 넣어 시험관으로 옮긴다.

 

11) shaking incubator에 30분간 배양한다.

 

12) 원심분리(14000rpm)을 3분동안 하고, 상층액을 제거한다.

 

13) LB 200㎕를 넣고 resuspention시킨다.

 

14) 대장균을 선택배지(LB+Km+X-gal)에 50㎕, 150㎕로 나누어 배양한다.

 

 

 

[보건환경미생물학실험]Heterologous expression of the transformed gene 레포트