보건환경미생물학실험 | Observation of the expressed protein via SDS-PAGE

 

 

 

TIP

 

 

SDS-PAGE를 통해서 미생물이 발현한 단백질을 크기로서 구분해내고자 한다.

 

 

 

2-D electrophoresis

후에 그 튜브는 수직판 겔의 윗부분과 수평적으로 위치하고 단백질의 그 튜브 밖으로 나와서 크기에 따라 분리되는 젤로 이동한다. 그것이 2-D gel이며, SDS가 사용되고, 계면활성제는 단백질의 소수성 부위에 붙어 모두 음전하를 만든다. 단백질은 같은 전하이므로 전하보다는 M.W.에 의해 분석된다. 음전하를 띠는 단백질은 양전하 쪽으로 이동한다.

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실험 방법

1. IPTG Induction

1) pPSC1(pPROEX-1 + pnrB)가 도입되어 있는 E. coli BL21을 LB에서 37℃ overnight로 배양한다.

 

2) 계대배양으로 pPSC1 : LB를 1:100 또는 1:50으로 희석(dilution)한다.

 

3) 3시간에서 3시간 30분까지 37℃에서 shaking incubation한다.

 

4) IPTG(0.5mM～1mM)로 유도하고, 1㎖의 형질도입이 안 된 세포를 넣는다.

 

5) 균은 분열을 중단하고, 단백질을 생성하기 시작한다.

 

6) 4～5시간 더 배양한다. 37℃ shaking incubator를 사용한다.

 

7) pellet을 형성하기 위해 5000rpm에서 도입된 세포들을 원심 분리한다. 그리고 -20℃에서 pellet을 저장, 보관한다.

 

2. SDS-PAGE

1) 전기영동 장비들을 조립한다.

① stacking gel을 pH 6.8 에서 1시간 굳힌다.

ⓐ 30% acrylamide 10.8% bisacrylamide 0.65㎖

ⓑ 4× Tris-HCl pH 6.8 buffer/SDS 1.25㎖

ⓒ ddH₂O 3.05㎖

ⓓ 10% ammonium persulfate 25㎕

ⓔ TEMED 5㎕(gel이 굳는 속도를 빠르게 함. separating gel을 굳히기 위해, 산소를 막기 위해서 물을 부어준다.)

 

② saparating gel을 pH 8.8로 1시간동안 굳힌다.

ⓐ 30% acrylamide, 10.8% bisacrylamide 6㎖

ⓑ 4× Tris-HCl pH 8.8 buffer/SDS 3.75㎖

ⓒ ddH₂O 5.25㎖

ⓓ 10% ammonium persulfate 0.05㎖

ⓔ TEMED 0.01㎖

 

2) sample을 실어 올린다. (실어 올리기 전에 10분 동안 sample을 끓었다.)

 

3) 전기영동을 1시간 정도 동안 100voltage에서 가동한다. stacking gel에서 80v 30분, separating gel에서 90v 40분이다.

 

4) 조립했던 전기영동 젤 장비들을 분해하고 gel을 꺼낸다.

 

5) Coomassie Blue가 들어있는 staining용액을 부어 shaker 위에서 15분간 shaking 해준다.

 

6) 페트리 디쉬에서 gel만을 꺼낸 다음, destaining 용액을 붓고, shaker 위에서 15분간 shaking 해준다.

 

7) size marker로 원하는 단백질이 발현되었는지 확인을 한다.

 

 

[보건환경미생물학실험]Observation of the expressed protein via SDS-PAGE 레포트