일반생물학실험 | DNA 추출

 

 

 

TIP

 

 

플라스미드라는 유전체이외의 자가복제 DNA의 분리를 통하여 DNA의 추출 및 정제방법의 원리를 배우고, DNA의 이화학적 특성을 이해한다.

 

 

 

DNA의 발견

1869년 스위스의 화학자인 미셔는 고름에서 채취한 백혈구 핵의 단백질 을 펩신으로 분해한 결과 인을 함유한 물질이 남는 것을 발견하고, 이 물질이 유전 물질일지도 모른다고 추측했다. 그 후 1914년에 독일 화학자인 포일겐은 DNA의 양에 따라 세포핵의 염색 정도가 달라지는 ‘포일겐의 염색법’을 발명하여 DNA의 양을 계산하였다. 그 결과 한 생물체 내의 세 포핵은 모두 같은 양의 DNA를 가지고 있으며, 난자와 정자는 그 절반만 을 가지고 있다는 것을 밝혔다. DNA의 존재가 알려졌음에도 불구하고 1940년대까지 많은 과학자들은 조성이 단순한 DNA보다는 구조가 복잡하고 종류가 많은 단백질이 유전 물질이라고 생각하였다.

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실험 방법

1. 플라스미드 DNA 추출 원리

1) Resin을 이용한 플라스미드의 정제

① LB배지 2㎖에 하룻밤 37℃에서 배양한 세균을 미세원심 분리기로 10,000rpm 1분간 원심 분리하여 침전한다.

② 200㎕의 Cell resuspension Solution에 세포를 잘 현탁한다.

③ 200㎕의 Cell lysis Solution을 넣고 튜브를 뒤집어서 용액을 투명해질 때까지 충분히 섞는다.

④ 200㎕의 Neutralization Solution을 놓고 역시 튜브를 뒤집어서 충분히 용액을 섞는다.

⑤ 미세원심분리기에서 10,000rpm, 10분간 원심분리하여 상등액을 얻는다.

⑥ 상등액을 새 튜브에 옮기고 여기에 resin을 1㎖ 첨가하여 튜브를 뒤집어 충분히 섞는다.

⑦ 3㎖ 일회용 주사기의 밀대를 뽑고 주사기통을 mini column에 연결한다.

⑧ resin과 상등액 혼합물을 주사기통 내의 미세피펫으로 주입하고 주사기 밀대로 천천히 벌린다.

⑨ 주사기통을 Column에서 분리시킨 다음, 밀대를 뽑은 후, 다시 주사기 통만을 Column에 연결시키고 2㎖의 Colu㎚ Wash Solution을 주사기통 내에 주입한다.

⑩ 주사기밀대로 Column Wash Solution을 천천히 밀어서 Colu㎚내의 resin을 세척한다.

⑪ Column을 새 튜브에 옮기고 50㎕의 Tris-EDTA buffer를 Column안에 미세피펫으로 주입하고 1분간 방치한다.

⑫ 미세원심분리기를 사용하여 Column을 10,000rpm에서 30초간 원심 분리하여 DNA 용액을 용출시킨다.

 

2) 플라스미드의 정량

① DNA용액 10㎕를 1㎖의 탈 이온수에 넣어 100배 희석한다.

② UV/VIS spectrophotometer로 260㎚와 280㎚의 파장에서 흡광도를 측정한다.

③ DNA의 농도 계산 : OD 값 1에 해당하는 DNA농도는 50㎍/㎖이다. 따라서 농도는  A₂₆₀ × 50 X_n (n=희석배수)가 된다.

④ A₂₆₀/A₂₈₀의 비가 1.8이상이면 단백질의 혼입이 없는 것으로 판단한다.

 

2. DNA 전기영동 분석 원리

1) 꽂혀있는 comb를 수직으로 조심스럽게 뽑아낸다.

 

2)  종이 테이프를 떼어내고 Well이 있는 쪽이 음극을 향하도록 gel을 gel 판과 함께 전기 영동조에 넣는다.

 

3)  전기영동 완충액을 gel 위로 1㎜정도 올라간 만큼 부어준다.

 

4)  다음의 시료 10㎕에 아가로스 젤 부하용액 2㎕을 섞어서 준비한다.

 

5)  첫 번째 lane에는 ∧/HindIII DNA, 두 번째 lane에는 준비한 DNA 시료를 부하한다.

 

6)  음극쪽 백금선에는 공기 방울이 생기는지 확인한다. bromophenol blue가 젤판의 2/3정도 진행할 때까지 영동시킨다. 전기영동시 강한 전류가 흐르고 있으니 손이 전기영동조 안에 닿지 않도록 주의한다.

 

7)  전기 영동이 끝나면 비닐 장갑을 기고 젤판에 놓인 채로 그래도 젤을 꺼낸다.

 

8)  젤을 UV transilluminator위에 놓고 gel documentation system으로 영상화하여 DNA band의 위치를 확인한다.

 

 

 

[일반생물학실험]DNA 추출 레포트