일반생물학실험 | 혈액에서 DNA 추출

 

 

 

TIP

 

 

1. 혈액에서 DNA를 추출한다
2. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 산물을 만든다.

 

 

 

PCR

DNA 사슬 중에서 목적하는 일부분만을 대량으로 증폭시키는 방법으로 뮬리스에 의해 고안된 방법이다. 처음에는 대장균에서 분리한 DNA 중합효소 I을 사용하였으므로 사이클이 지날 때마다 효소를 첨가해야 하는 불편 때문에 널리 이용되지 않았으나 사이키가 높은 온도에서도 그 활성이 없어지지 않는 Taq DNA 중합효소를 발견한 후 실험방법이 보편화되었다.

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실험 방법

1. 시작하기 전에

1) 프로테아제 K 1병을 뉴클레아제 프리워터 1,250pl에 완전히 녹인다.

2)  WA1 버퍼에 30㎖ absolute ethanol 넣는다.

 

2. 전혈에서 DNA 추출

1)  단백질 분해효소 K 20㎕를 1.5㎖ 또는 2㎖ 튜브에 넣는다.

 

2)  튜브에 전혈 200㎕ 넣는다.

 

3)  시료에 GB (gel binding; DNA가 잘 붙을 수 있게 하는 역할)buffer 200㎕ 첨가한 후 Vortex mixer

 

4)  인큐베이터 60℃ 10분 배양

 

5)  400㎕ absolute ethanol 넣고 마이크로 피펫으로 피펫팅(잘 섞기)(에탄올 역할은 물 분자들이 DNA를 용해시키는 것을 방해해서, DNA를 침전시킨다.)

 

6)  림 부분이 젖지 않도록 주의하며 Binding Column tube (채취 튜브)에의 상부 탱크로 옮김 (binding column tube 밑 부분에는 실리카 수지가 들어있어서 DNA를 binding 한다)

 

7)  튜브 닫고 8,000rpm 1분간 원심분리

 

8)  채취 튜브 용액 버리고 채취 튜브 재사용

 

9)  WA1 buffer 500㎕ 림을 적시지 않고 넣고 튜브 닫고 8,000rpm 1분 (washing buffer를 이용하여 DNA 이외의 물질은 씻어내준다)

 

10)  buffer란 실험과정에서 생길 수 있는 다양한 변화에 실험이 방해를 받지 않도록 일정하게 유지시켜주는 역할을 하는 물질

 

11)  채취관 용액 버리고 재사용

 

12)  W2 buffer 500㎕ 림 적시지 않고 넣고 tube 닫은 후 8,000rpm 1분간 원심분리(washing buffer를 이용하여 씻어내준다)

 

13)  채취관 용액 버리고 재사용

 

14)  13,000rpm 1분간 원심 후 에탄올 완전히 제거 후 binding column tube 바닥에 물방울 달라붙지 않는지 확인. (없으면 생략)

 

15)  Binding column tube를 새 1.5㎖ tube 에 옮겨 녹인 후 Binding column tube 에 EA (elution) buffer 50∼200㎕ 넣고 RT(15∼25℃, 상온)에서 1분 이상 기다림(EA buffer를 이용하여 실리카 수지에서 DNA만 추출)

 

16)  원심분리하여 elute(용리) 8,000 rpm 1분(elute된 DNA는 눈에 보이지 않는다.)

 

3. PCR 튜브 제작 (50㎕ 용량으로 제작)

1)  장갑, 고글을 착용한다.

 

2)  주형 DNA와 primers를 PCR master mix tube 에 넣는다.

 

3)  증류수를 tube에 넣고 전체 부피를 50㎕으로 맞춘다.

 

4)  PCR master mix 25㎕ + template DNA 1㎕ + forward primer 2㎕ + reverse primer 2㎕ + D.W 20㎕ = total volume 50㎕

 

5)  피펫으로 부드럽게 섞어준다.

 

4. PCR 실행

Step 1	pre-denaturation	95℃	5min	1 cycle
Step 2	denaturation	95℃	20sec	25-35 cycles
	annealing	45-65℃	20sec
	extension	72℃	30sec∼1min/kb(40sec)
Step 3	final extension	72℃	3∼5min(5min)	1 cycle

 

5. 전기영동 돌리기

1) DNA 추출 잘 됐는지 확인, 목표 유전자 부위 HLA DQ – alpha, beta

 

2)  HLA(human leukocyte antigen;조직적합성항원)은 장기이식과 관련된 여러 항원중 하나, 염색체 6p 21, 31 위치

 

3)  겔 장착(시판 겔 사용, 염료처리 되어있다)

 

4)  TAE buffer solution 붓는다. (10x, 샘플이 잠길정도로 붓는다)

 

5)  TAE buffer는 tris, acetate, EDTA 성분 들어있는데, tris는 양이온을 공급하여 마이너스 (–)charge를 띠고 있는 DNA를 끌어주는 역할, 그러나 tris는 pH가 11에 가까울 정도로 높기 때문에 DNA가 해리될 수 있어 acetate로 pH를 낮춤. 그리고, EDTA는 Dnase inhibition에 의한 DNA 분해를 방지, DNA의 – charge 유지

 

6)  샘플 로딩 (30㎕)

 

7)  뚜껑닿고 전기장 걸기(10분)

 

8)  UV에서 결과 확인하기

 

 

[일반생물학실험]혈액에서 DNA 추출 레포트