일반생물학실험 | 원핵세포 배양 및 관찰

 

 

 

실험 개요

원핵세포란 원핵생물을 구성하고 있고 개체가 단 하나로만 이루어진 단세포이다. 원핵세포는 하나의 염색체만 가지고 있고 진핵세포와 다르게 유사분열을 하지 않으며, 진핵세포보다 요구하는 영양분이 까다롭지 않아 세포배양에 주로 쓰인다. 또한 원핵세포는 다른 세포와 달리 세포주기가 매우 짧아 번식과 증식이 빠르다. 세포배양에 쓰이는 대표적인 균인 대장균은 20분에 한 번씩 분열한다. 하지만 이것은 진핵세포를 완전히 배양하지 않는다는 것은 아니다. 진핵세포를 배양할 때에는 주로 세대수가 짧은 물고기나 생쥐를 이용한다.

 

세포배양은 생물학 연구 전체에서 가장 유용한 기술이다. 세포배양의 장점은 단일 배양세포를 대량으로 얻을 수 있고 그 중 돌연변이의 관찰도 비교적 용이한 것이다. 초기의 조직배양은 명확하지 않은 물질이 포함된 배양액을 사용하였다. 그 중에는 생체에서 얻은 혈청, 배아 균질액 등이 첨가되었다. 하지만 거듭된 실패로 과학자들은 세포를 증식시키고 관찰하기 위해 다양한 종류의 영양분과 성장인자 등이 요구된다는 것을 알게 되었다. 또한 현재까지도 세포 배양액에는 다량의 혈청 또는 혈청에 포함된 성장인자가 함유되어 있다. 그렇게 완성된 배양액은 영양분이 풍부하기에 미생물이 증식하기에 완벽한 조건을 갖추었다.

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실험 방법

1. 액체 LB plate 제작

1)  메스실린더에 약 95㎖의 증류수를 담았다.

 

2)  전자저울에 X자로 접었다 편 유산지를 올리고 tryptone, yeast extract, NaCl이 모두 포함되어 있는 kit를 2.5g 저울하여 병에 넣고 병을 둥글게 돌리며 잘 섞어주었다.

 

3)  잘 섞인 용액을 다시 메스실린더에 넣고 총 100㎖가 되도록 증류수를 추가하였다.

 

4)  100㎖의 용액을 다시 병에 넣고 뚜껑을 꽉 닫지는 않고 조금 열어둔 뒤, 그 위를 정사각형의 알루미늄 포일로 감쌌다.

 

5)  Autoclave 121, 1.5기압, 15mins (약 1시간 소요)

 

2. 고체 LB plate 제작

1)  액체 LB plate와 동일한 방법으로 용액을 만들어준 후에 1g의 Bacto-Agar를 저울하여 병의 용액에 넣었다.

 

2)  병의 뚜껑을 꽉 닫지 않고 조금 열어둔 뒤, 그 위를 정사각형의 알루미늄 포일로 감쌌다.

 

3)  Autoclave 121, 1.5기압, 15mins (약 1시간 소요)

 

4)  6개의 페트리디시에 조, 세포종류, 날짜를 주기하였다.

 

5)  멸균된 LB를 autoclave에서 꺼내어 clean bench에서 페트리디시의 바닥을 덮을만큼 부어 6개의 페트리디시를 채우고 약 20분 간 굳혔다.

 

3. 세균 도말

1)  굳은 LB plate에 열개의 손가락 모두 살짝 찍은 후 뚜껑이 아래로 가게 놔두고 실험자의 이름을 주기했다.

 

2)  세균 도말을 완료한 페트리디시는 37의 배양기에 넣어 overnight 배양하였다. 그 후 페트리디시를 parafilm으로 실링하여 4에 보관하였다.

 

3)  사용하지 않은 고체 배지는 parafilm으로 틈을 실링하여 밀봉한 후 4에 보관하였다.

 

4. 단일염색법

1)  슬라이드글라스 위에 증류수를 한 방울 떨어뜨렸다.

 

2)  멸균된 루프로 고체 배지 위의 콜로니들 중 하나를 묻힌다는 느낌으로 떠서 슬라이드글라스의 증류수에 혼합시켰다.

 

3)  루프로 콜로니를 최대한 넓게 도말하였다.

 

4)  실온에서 수분을 증발시켰다.

 

5)  콜로니를 도말한 부분에 크리스탈 바이올렛 용액을 한 두 방울 떨어뜨려 흐르게 한 후 1분간 놓아두었다.

 

6)  콜로니를 도말한 부분의 반대편에 수돗물을 2～3초 간 흘러 보낸 후, 실온에서 수분을 증발시켰다.

 

7)  커버글라스를 덮지 않은 슬라이드글라스로 세균을 관찰하였다.

 

5. 단일 콜로니를 이용한 미생물의 순수 배양

1) 액체 배지 3㎖를 배양용 튜브에 넣었다.

 

2)  고체 배지 위의 단일 콜로니를 피펫 팁을 이용하여 살짝만 채취하였다.

 

3)  콜로니가 묻음 피펫 팁을 배양용 튜브에 넣어주었다.

 

4)  튜브의 뚜껑을 한 번만 닫고 진탕배양기에서 37, 225rpm으로 1시간 동안 배양하였다.

 

5)  클린 벤치를 켜고 삼각봉 및 도구들을 소독하였다.

 

6)  배양한 시료 100㎕를 따서 고체 배지에 도말하였다.

 

7)  도말한 고체 배지를 37에서 overnight으로 배양하였다.

 

8)  배양이 완료된 고체 배지는 parafilm으로 실링하여 4에 보관하였다.

 

 

 

[일반생물학실험]원핵세포 배양 및 관찰 레포트