분자생물학실험 | Restriction digestion

 

 

 

TIP

 

 

1. Plasmid DNA를 restriction enzyme(제한효소)로 처리하여 restriction enzyme의 특성과 plasmid의 특성을 이해한다.
2. Agarose gel 전기영동의 원리를 이해하고, 크기와 모양에 따른 DNA의 위치를 통하여 제한효소 지도를 작성한다. 

 

 

 

실험 배경

restriction enzyme은 특이성에 따라 DNA의 특정한 site를 찾아서 잘라준 다. 이 실험에서 쓰이는 enzyme은 DNA상에서 특정한 site를 인식하여 T 와 C사이의 phosphodiester bond를 끊어준다. 그렇게 끊어주면 circular한 plasmid DNA는 잘려서 linear한 형태로 나타난다. agarose gel electrophoresis은 DNA 조각을 분리하고 인식하는데 사용하는 가장 일반적인 방법이다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 다음의 cocktail (enzyme + buffer) 9㎕를 pipetting한다.

Hind Ⅲ cocktail Component stock vol/reaction enzyme 10 U/㎕ 1㎕ buffer 10 X 1㎕ water - 7㎕ total 9㎕

No enzyme cocktail Component stock vol/reaction buffer 10X 1㎕ water - 8㎕ total 9㎕

 

2) Cocktail에 plasmid DNA 1㎕를 첨가한다 (0.5㎍).

 

3) 37℃에서 2hr 또는 overnight 동안 incubation한다.

 

4) 65℃ water bath에서 15min 동안 enzyme을 inactivation시킨다.

 

5) Reaction mixture (10㎕)에 gel loading dye 10㎕을 첨가한다.

 

6) -20℃에 다음 시간까지 보관한다.

 

2. Agarose Gel Electrophoresis

1) 만들어진 sample 10㎕를 준비된 agarose gel에 pipette를 이용하여 loading한다. Size marker는 5㎕를 loading한다

 

2) 200V , 80mA로 전개한다.

 

3) gel을 ethidum bromide용액에 5∼10분간 염색한다.

 

4) 증류수로 destaining한다.

 

5) UV light box를 통하여 band를 관찰하고 Gel logic 100 Image System으로 사진을 찍는다.

 

3. Data Presentation

1) Gel 사진을 photoshop으로 똑바로 하고 적당한 크기로 자른다.

 

2) Power Point에서 size marker와 sample을 표시한다.

 

3) Word로 옮겨 그림번호와 legend를 작성한다.

 

4) Gel 사진에서 size marker의 전개거리를 측정한다.

 

5) Excel에서 전개거리와 분자량의 크기에 대해 graph를 그린다.

 

6) Word로 옮겨 표 번호와 그림의 번호 및 legend를 작성한다.

 

 

 

[분자생물학실험]Restriction digestion 레포트