유전공학실험 | Plant Genomic DNA isolation

 

 

 

TIP

 

 

1. 식물에서의 DNA 추출하는 방법을 안다.
2. Agaros Gel Electrophoresis 방법과 그에 따른 식물 DNA 양상을 안다.

 

 

 

식물의 DNA

식물은 진핵생물이므로 그 DNA 또한 진핵생물의 일반적인 DNA와 거의 유사하다고 할 수 있다. 최근에 이 식물세포가 동물과 거의 유사한 유전자의 구조와 기능을 가지고 있으나, 광합성 등 식물에 특이적인 기능에 관련된 유전자 및 유전현상 또한 많이 존재하고 있기 때문에 그러한 현상들을 근본적으로 분자의 측면에서 접근하는데 노력하고 있다.

 

또한 동물과 비교하여 식물은 외부유전자의 삽입을 통한 새로운 형질을 얻는 과정이 용이한 장점을 가지고 있다. 이러한 장점으로 인해 재조합 DNA기술을 이용하고 식물유전자를 cloning하여 유전자 조작 및 식물에 재도입을 통한 발현양상을 조사하는 등을 수반하고 있다. 그러한 연구 결과를 응용하여 품종개량 등에 이용하고 있는 것이다. 식물세포에는 핵, 엽록체, 미토콘드리아의 세포소기관들에 DNA가 존재하고 있으며, 서로 간에 유전 물질들은 상호보완적으로 이루어지고 있다.

 

1) Nucleus DNA의 구조

식물세포의 핵은 일반적으로 약 1m 길이의 매우 긴 DNA를 갖고 있다. 이 DNA는 식물의 생장과 발생에 필요한 거의 대부분의 유전정보를 간직하고 있다. 핵 DNA는 특별한 구조를 이루게 되어, 직경이 약 3∼20㎚인 핵에 함유되어 있다. 이 DNA는 식물의 종류에 따라 다른 수의 chromosome에 나뉘어져 있다. DNA는 여러 종류의 단백질과 함께 chromatin이라는 구조를 이루고 있다.

 

 

이러한 단백질의 대부분은 histone이며, 그밖에도 여러 유전자 기능에 관련된 것들이 있다. 이런 chromatin 구조는 세포의 복제, 환경 및 발생조건들에 따라 구조가 바뀌게 되어 특이적인 유전자의 기능이 이루어지게 된다. 식물의 종류에 따라 DNA의 길이는 매우 다양하다. 일반적으로 개화식물은 109∼1011bp을 가지고 있다. 이런 긴 DNA는 모두 유전자로서 암호화되지 않으며(대부분의 DNA는 직접적으로 세포 기능에 관여하지 않음), 10% 미만이 암호화 기능을 갖고 있다. 식물에서 핵 DNA의 특징은 염색체가 이배수체 이상이 되는 다배수체(polyploidy)인 경우가 많은데, 이것이 유사한 식물 종간의 DNA의 양의 차이를 보이는 이유 중의 하나이다.

 

2) Chloroplast DNA

엽록체 DNA는 엽록체의 모든 단백질을 암호화하지는 못하며, 이들은 핵 DNA에 의해서도 만들어지고 있다. 즉 엽록체가 독립적으로는 광합성을 포함한 대부분의 엽록체 기능을 수행할 수 없고, 이런 기능은 핵과 엽록체와의 매우 유기적인 관계로 이루어져 있다. 엽록체를 포함한 모든 색소체의 DNA는 원형으로 되어 있으며, 길이는 110∼210kb 정도이다. 일반적으로 광합성이 활발한 세포는 한 세포 안에 40개 정도의 동일한 DNA를 갖고 있다. 엽록체 DNA는 약 90개 정도의 유전자를 포함하고 있으며, 이중 대부분은 tRNA, rRNA 등 단백질 합성에 관련된 유전자와 광합성 관력 단백질을 암호화하는 유전자들로 구성되어 있다.

 

3) Mitochondria DNA

식물의 미토콘드리아 DNA는 다른 종의 생물보다 매우 길며(200∼2500kb), 일정하지 않은 구조를 하고 있다.

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실험 방법 : Dellaporta Protocol, 1983

1. First week : 실험 기구 및 시약

1) Extraction buffer(EB) ⇨ 총 100㎖ 만들기

 

2) 50mM Tris-HCl, pH 8.0 : 500㎕

 

3) Buffer의 pH를 맞추는 역할

 

4) 이가 양이온의 착화합물

 

5) 100mM NaCl : 1000㎕(1㎖)

 

6) D.W. 100㎖에 5.844g의 NaCl 섞기

 

7) 단백질을 파괴함으로써 세포막 파괴시킴

 

8) S-S 결합 해체 → 단백질 denaturation

 

9) 식물의 대사진행 과정을 막기 위해 -198℃ 액체 질소 첨가

 

2. Second week : DNA 정제

1) 100㎎ plant sample in 1.5㎖ tube

 

) 750㎕ EB buffer in 1.5㎖ tube

 

3) Invert 7∼8 times and put in 65℃ water bath (more than 10min)

 

4) 250㎕ 5M potassium acetate in 1.5㎖ tube

 

5) Invert several times and put ice (more than 20min)

 

6) Cetrifuge for 10min (4℃, 12000rpm)

 

7) Decant supernant in new 1.5㎖ tube and put same volume of Isopropanol

 

8) Invert gently for several times and centrifuge 12000rpm for 10min (DNA pellet)

 

9) Discard the supernant and put 80% EtOH

 

10) Cetrifuge for 2∼3min

 

11) Discard the supernant and air dry it

 

12) Put 50㎕ TE and dissolve the DNA

 

13) Put 50㎕ 3M Sodium acetate and 500㎕ isopropanol

 

14) Invert gently and cetrifuge for 30sec

 

15) Same as No. 9∼10

 

16) Put 20∼30㎕ TE and dissolve the DNA

 

3. Third week : Agaros Gel Electrophoresis(전기영동)

1) Reagent and materials

① Mupid-21 set (전기영동 세트), Yellow tip, Micro pipette 20㎖, 파라필름, E-tube 렉, 비커

 

② 1000㎖ 삼각플라스크, 100㎖ 메스실린더, Loading dye, 변압기, Agarose

 

③ 40× TAE, D.W., Balance, EtBr

 

2) Method

① Prepare enough electrophoresis buffer (1× TAE) → DNA는 항상 안정한 상태로 유지되어야 하기 때문에 완충액 필요

 

② Put 0.8% Agarose to 100㎖ TAE

 

 

③ Heat gel solution to boiling in a microwave

 

④ Put 3㎕/100㎖ EtBr in solution after microwave

 

⑤ Prepare the gel box, casting tray and well-forming comb

 

⑥ Pour the hot(liquid) gel into the casting tray, than do not move your assembly until it has solidified

 

⑦ Very gently remove the comb and put in gel box → Comb 제거 시, 수직으로 빼도록 한다.

 

⑧ Add electrophoresis buffer to the gel box

 

⑨ Resuspend the DNA sample in Loading buffer

 

⑩ Gently pipette the sample into the well and cover the gel box

 

⑪ Run the gel at 100V for 10min

 

⑫ View the gel using a special ultraviolet light box

 

⑬ Photograph the gel for a permanent record of the experiment

 

 

 

[유전공학실험]Plant Genomic DNA isolation 레포트