반응형 생화학실험 | 단백질 정량 분석 - BCA법 & SDS-PAGE 분석 & Western Blot TIP BCA Method를 이용하여 우유 중의 단백질 함량을 분석하고 SDS-PAGE와 Coomassie Blue 염색을 통해 단백질의 전기영동 결과를 관찰한 것을 바탕으로 Western Blot을 시행하여 membrane에 transfer시켜, 항원-항체 반응을 이용하여 특정한 단백질의 정량 분석과 검출하는 방법을 실험을 통해 숙지한다. 실험 방법 1. 단백질 정량분석-BCA법 1) Sample & stardard 제조 ➀ 우유 속에는 약 5%의 단백질이 들어 있고, 1㎖속의 우유에는 약 50㎎이 들어 있는데, BCA법의 정략정 단백질 양 범위는 20~2000μg/㎖이므로 이를 1/100으로 희석하여 Epp. tube에 담았다. ➁ Albumin Standard Ampules의 농도는 2.0㎎/㎖이기.. Biology/생화학 2020. 6. 7. 생화학실험 | Western Blot TIP 항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하여 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 분석하는 western blot의 원리를 이해하고, 단백질의 SDS-PAGE분리, 단백질의 gel로부터 membrane으로의 transfer, 항체반응 및 항체에 부착된 효소의 반응에 의한 발색반응 등의 실험기법을 습득한다. Immunoblot(western blot)의 원리 immuno blot이라고도 부르는 western blot은 antigen과 antibody사이의 특이적인 결합을 이용하여 시료 속에 위치한 단백질을 정성적/정량적으로 분석하는 방법이다. 단백질이 transfer되어있는 membrane에 원하는 단백질의 antibody를 넣어주면 항원 항체반응을 일으켜 antibody가 원하는 단백질 band에.. Biology/생화학 2020. 5. 26. 분자생물학실험 | Western blotting Western blot은 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정단백질을 찾아내는 기법으로서 찾고자 하는 단백질에 대한 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 일으킴으로써 특정단백질의 존재여부를 밝혀낸다. 특정 단백질을 찾기 위해서 먼저 gel electrophoresis를 이용하여 크기별로 분리해낸다. 단백질을 순수하게 크기별로 분리해 내기 위해서는 단백질의 단위 질량당 charge와 3차원 folding 구조를 모두 같게 해줘야 한다. 이런 이유로, 단백질은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro phoresis)를 수행한다. 이는, SDS를 detergent로서 이용하여 단백질을 모두 단위 질량당 같은 정도의 negative charge를 띠.. Biology/분자생물학 2020. 4. 24. 영양생화학실험 | SDS-PAGE에 의한 단백질 분리와 Western Blotting TIP SDS-PAGE로 단백질을 분리한 후 전기영동을 통해 단백질의 분자량을 측정, 단백질항체이용 분석을 할 수 있다. Western Blot 표적 단백질에 대한 항체를 이용하여 항원-항체 반응으로 그 단백질을 확인하는 방법. 단백질을 비특이적으로 결합하는 nitrocellulose paper의 특성을 이용하여 SDS-PAGE 방법으로 분리된 단백질을 NC종이로 전기이동 시킨 다음 특정 단백질에 대한 항체를 이용하여 그 특정 단백질의 존재 여부, 위치, 양 등을 확인할 수 있다. 먼저 NC종이로 옮겨진 단백질이 더 이상 비특이적으로 결합하지 않게 하기위해서 blocking 한 후 특정 단백질에 대한 항체인 1차 항체를 결합시킨다. 항체에 대한 단백질의 결합은 특이적이므로 강하게 붙어 있는다. 이를 보기.. Engineering/식품 영양 | 공학 2020. 4. 2. 분자생물학실험 | Protein assay and Western blot TIP 1. Protein assay : Cell에서 protein을 추출하는 과정을 이해하고, protein assay(BCA method)을 이용하여 단백질의 함량을 측정할 수 있음을 이해한다. 2. Western blot : Protein sample을 membrane에 transfer하고, Western blot을 통하여 항원-항체 반응을 유도하여 원하는 특정 단백질을 detection 할 수 있음을 이해한다. 실험 방법 1. 실험 과정 1) 10% SDS gel 만들기 2) Protein assay ① Standard curve (BSA + DW + BCA solution) ② BCA solution = BCA : Cu++ = 50 : 1 ③ Sample (Protein + DW + BCA so.. Biology/분자생물학 2020. 3. 24. 생명과학실험 | Immunoprecipitation Immunoprecippitation(면역침강법) 특정 단백질의 존재를 확인하기 위해 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 결합 시키는 방법이다. 이때 보통은 antigen-antibody 만을 넣어 특이적 결합을 시킨다 하여도 그걸 눈으로 확인할 방법이 없으니 그것을 위해 무거운 bead를 넣어 침전물이 발생하게 만든다. 이런 Immunoprecippitation의 방법에는 Individual protein immunoprecipitation (IP), Protein complex immunoprecipitation (Co-IP), Chromatin immunoprecipitation (ChIP), RNA immunoprecipitation (RIP) 등의 방법이 있으나 Chromatin i.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 11. 14. 이전 1 다음 반응형