분자생물학개론 | Protein Purifying

 

 

 

TIP

 

 

1. The Preparative Ultracentrifuge
2. Organelles and Macromolecules Can Be Separated Separated by Ultracentrifugation
3. Cell fractionation by centrifugation
4. Velocity Sedimentation
5. Equilibrium Sedimentation
6. The Separation of molecules by Column Chromatography
7. Ion-Exchange Chromatography
8. Ion-Exchange Matrix
9. Protein purification by Ion-Exchange Chromatography
10. Gel-filtration Chromatography
11. Protein purification by Gel-Filtration Chromatography
12. Affinity Chromatography
13. Protein purification by Affinity Chromatography
14. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
15. Epitope tagging for the localization of purification of proteins
16. Purification for GST-fusion proteins

 

 

 

The preparative ultracentrifuge

매분 수만 회 이상의 고속으로 회전시켜 중력 가속도의 수십만 배에 이르는 원심가속도를 만들어내는 원심분리기이다.

 

초고속 회전으로 큰 원심력을 발생시켜 단백질 분자량을 측정하는 장치. 1923년 스웨덴의 화학자 스베드베리가 고안해냈다. 이 장치는 대단히 빨리 회전하기 때문에 용액 속의 단백질 분자가 바깥쪽으로 밀려나게 되는데, 이때 단백질 분자의 침강속도를 알아내고 이것을 이용해 단백질의 분자초전도량을 측정해낸다.

 

오늘날 초원심기의 회전수는 분당 7만5000이다. 용액이 들어 있는 튜브를 초고속으로 회전시킴으로써 강한 중력장(重力場)을 발생시켜 용질(溶質)의 침강속도(沈降速度)를 높이는 장치이다.

 

유전자, 단백질, 세포 내조직, 기관을 분리하는 데 있어 sample의 정제도가 정밀하게 요구되는 연구에 필수적인 장비이다. 단백질 정제는 단백질의 기능을 이해하는데 꼭 필요한 첫 번쨰 단계이다. 단백질들이 정제되려면 세포로부터 방출되어야한다.

 

세포막을 파열시켜서 세포파쇄액(homogenate)을 만든다. 그리고 원심분리법으로 혼합물을 분별분리하면 무거운 물질의 뭉친 덩어리가 원심분리관의 밑바닥에 가라앉고 좀 가벼운 상층액은 위에 뜨게 된다. 상층액을 더 센 원심력으로 다시 원심분리하여 또 다른 뭉친 덩어리와 상층액을 생기게 한다. 분별 원심분리(differential centrifugation)라는 절차는 밀도가 점점 감소하는 몇 개의 분획들을 내는데, 각 분획은 아직 수백가지의 다른 단백질을 함유한다. 각 분획들은 정제하고 있는 효소의 활성에 대해서 따로따로 분석된다. 보통은 이러한 활성이 한 분획에 농축될 것이며, 그 다음에 이 분획을 더 구별력이 있는 정제법에다 적용할 재료로 사용한다.

 

 

Organelles and Macromolecules Can Be Separated Separated by Ultracentrifugation

단백질들이 정제되려면 세포로부터 방출

 

세포막을 파열시켜서 세포파쇄액(Homogenate)을 만든다. ⇒ Before

 

원심분리법으로 혼합물을 분별분리하면 무거운 물질의 뭉친 덩어리가(Pellet) 원심분리관의 밑바닥에 가라앉고 좀 가벼운 상층액은 (Super natant) 위에 뜨게 된다. ⇒ After

상층액을 더 센 원심력으로 다시 원심분리하여 또 다른 뭉친 덩어리와 상층액을 생기게 한다.

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How to Perform Centrifugation

 

 

 

SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

 

 

 

 

[분자생물학]Protein Purifying 레포트