반응형 분자생물학실험 | Restriction digestion TIP 1. Plasmid DNA를 restriction enzyme(제한효소)로 처리하여 restriction enzyme의 특성과 plasmid의 특성을 이해한다. 2. Agarose gel 전기영동의 원리를 이해하고, 크기와 모양에 따른 DNA의 위치를 통하여 제한효소 지도를 작성한다. 실험 배경 restriction enzyme은 특이성에 따라 DNA의 특정한 site를 찾아서 잘라준 다. 이 실험에서 쓰이는 enzyme은 DNA상에서 특정한 site를 인식하여 T 와 C사이의 phosphodiester bond를 끊어준다. 그렇게 끊어주면 circular한 plasmid DNA는 잘려서 linear한 형태로 나타난다. agarose gel electrophoresis은 DNA 조각을 분리하고 인.. Biology/분자생물학 2023. 5. 17. 분자생물학실험 | 성장곡선 그리기 TIP 배지 속 세균의 성장을 흡광도를 측정하여 그래프를 작성 및 해석해보자. 생장 곡선 1. lag phase 균을 새로운 배지에 접종하여 배양할 때 배지에 적응하는 시기로서 세포가 새로운 환경에서 증식하는데 필요한 각종 효소 단백질을 생합성하는 시기이다.분열을 위해 세포의 크기가 커지고 호흡활성 도가 높아지는 시기이며, 세포내의 RNA양은 현저하게 증가하고 효소단백질 합성이 왕성해진다. 2. exponential phase 미생물의 발육 과정에서 속도가 최대가 되는 시기. 균의 세대시간이 가장 짧고 대사산물이 원형질의 합성에 가장 잘 이용되는 시기이다. 3. stationary phase 세균이나 세포가 증식할 때에 대수증식기를 경과하면 분열, 증식이 정지하여 개체수의 증가가 나타나지 않는 상태를 유.. Biology/분자생물학 2023. 3. 7. 분자생물학실험 | Agarose gel electrophoresis TIP 일정한 pH의 전해질 용액 중에 단백질과 같은 입자를 부유시켜 전기장 내에 놓으면 이 입자는 전하를 띠어 반대 전극으로 이동하는데 이 현상을 전기영 동이라 하고 Agarose gel electrophoresis를 실험하자. 겔 전기영동 겔은 콜로이드(colloid) 용액이 굳어진 상태를 말하는 것이다. 전기영동이란 말은 전기적인 힘에 의해 전하를 띤 입자가 이동하는 것을 가리키는 표현이다. 따라서 겔 전기영동은 전류를 흘려주어서 전하를 가진 입자가 겔 내부에서 이동하여 분리되도록 하는 기술이다. DNA 나 RNA의 경우 주로 아가로스를 사용하고, 단백질의 경우 폴리아크릴아마이드 등을 굳혀서 겔을 만든다. 구조나 크기 등 입자의 성질에 따라서 겔을 통과하여 이동하는 속도가 달라지게 된다. 겔에 홈을.. Biology/분자생물학 2022. 9. 30. 분자생물학실험 | Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction(qRT-PCR) TIP 추출된 RNA로 합성한 cDNA를 이용하여 RT-PCR을 진행하고, 특정 유전자의 mRNA 발현량을 비교하여 sample을 평가한다. Housekeeping gene의 이용 housekeeping gene이란 세포에서 높은 수준으로 항상 발현되어 유지되는, 세포 생명활동에 필수적인 기능을 수행하는 유전자의 총칭이다. 외부 자극에 의해 발현이 크게 변하지 않는 특성이 있으며 대표적으로 액틴 단백질, 리보솜 단백질, GAPDH(Glyceraldehyde –3-phosphate dehydrogenase) 등이 있다. housekeeping gene은 높은 수준으로 발현되는, 즉 실험에서 넣어준 만큼 발현되기 때문에 PCR에서 특정 유전자의 전사 발현을 양적으로 비교할 때 대조군과 실험군에서 총 RNA .. Biology/분자생물학 2021. 11. 21. 분자생물학실험 | Flow cytometry(FACS)를 이용한 cell cycle 분석 TIP FACS의 기본원리를 익히고 적용하는 방법을 알아본다. 유세포 분석기 유액상태의 입자나 세포가 일정 감지 지역을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여 세포의 크기, 세포 내부 조성정도, 세포기능 인지등 한 세포가 갖는 여러 특징을 동시에 측정하고 경우에 따라 특정 세포들만을 선택하여 분리할 수 있는 장비이다. 유세포 분석기는 측정하고자 하는 세포집단의 세포들을 각각 하나씩 측정하여 분석하는 특징을 가진다. 유액상태의 입자나 세포를 감지하기 위해서는 일정 파장을 띄는 형광이 표지된 항체 같은 형광염 색소의 표지가 필수적이며, 형광을 감지하는 방법으로는 광원인 레이저광원을 통한 형광의 발광작용을 이용한다. 세포는 형광항체법에 따라 표지하지만 여러 가지 형광표지제 개발로 현재는 단일여기파장.. Biology/분자생물학 2021. 11. 17. 분자생물학실험 | Cell Migration assay TIP Cell migration을 유도하고 chemotaxis의 원리를 이해한다. Chemokines 케모카인은 약 100여개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질들의 집단으로, 선택적으로 백혈구 소집단의 세포접합, 화학유인작용, 활성화 등을 조절하는 cytokine을 말한다. 케모카인의 이러한 기능 때문에 이들이 염증반응에서 중추적인 역할을 하는 것이다. 케모카인은 림프조직 분아니라 비림프조직에서도 만들어져, 백혈구들이 림프조직이나 일반조직에서 이동하는 과정을 조절한다. 또한 케모카인은 혈관을 통과하여 조직으로 침투한 백혈구를 농도의 차이를 이용하여 염증부위로 유인하는 작용 (chemotaxix)도 나타낸다. 케모카인은 연속된 두개의 cystein의 위치에 따라 CC chemokine과 CXC chemo.. Biology/분자생물학 2021. 7. 8. 분자생물학실험 | 6X His tagged eGFP 단백질의 정제와 분석 실험 방법 1. 실험 과정 재조합 단백질(6X His tagged eGFP)의 발현과 정제를 위한 실험이다.먼저 GFP 발현하기 위해서 첫번째로 BL21 inoculation을 진행한다. 균을 다루는 실험(접종/배양)에서는 오염 방지를 위해 알코올 램프 위에서 진행한다. LB 5㎖을 시험관에 넣고, 여기에 Kanamycin 5㎕을 넣어준다. Loop를 살균하고 plate 뚜껑에서 식힌 후에 미리 spreading 해둔 BL21 plate(pET28a::egfp)에서 colony를 pick한다. BL21 inoculation completed라고 라벨링을 한 후에 37℃ shaking incubator에서 배양액에 공기의 공급이 잘 되게 튜브를 비스듬히 넣고 Overnight cultivation시킨다. .. Biology/분자생물학 2021. 3. 28. 분자생물학실험 | Competent cell을 통한 형질전환효율 측정 그리고 전기영동 실험 방법 1. 실험 과정 200㎖의 LB 배지를 만들기 위해서 먼저 가장 양이 많은 160㎖의 DIW(Deionized Water)를 비커에 채우고 용액을 섞기 위한 magnetic bar도 같이 넣어준다. 그리고 1%의 농도가 되도록 NaCl 2g을 넣고 0.5%의 Yeast extract가 되도록 1g을 넣는다. Tryptone도 1%가 되도록 2g만큼 넣어준 후에, magnetic bar로 섞는다. 이후 200㎖까지 남은 양은 DIW로 채워준다. 이후 멸균을 위해서 15분 동안 121에서 15psi로 autoclave를 시키고 끝나면 4에 둔다. 이후에 있을 실험을 위해서 agar plate가 필요하므로, Ampicillin과 Kanamycin agar plate를 만들어야 한다. 먼저 1000㎖.. Biology/분자생물학 2021. 3. 24. 분자생물학실험 | A. Tumefaciens의 Ti-plasmid를 이용한 담배식물체의 발현위치와 상호작용 실험 방법 1. 실험 과정 분주되어 있는 A. Tumefaciens (strain: GV3101)c-cell을 -70 Deep Freezer에서 꺼내 얼음에 담근다. 5분 정도 녹인 c-cell에 plasmid의 양을 1㎍, 0.1㎍, 0.01㎍로 다르게 넣어주고 c-cell이 깨지지 않게 조심스럽게 tapping하고 액체 질소에 2분 동안 얼리고 5분동안 waterbath에서 녹여준다. 그리고 다시 액체 질소에 동일하게 얼리고 waterbath에서 동일하게 녹여주어 형질전환의 효율을 높인다. 그 다음, 각각의 e-tube에 YEP medium을 1㎖만큼 넣어주고 200rpm으로 28의 shaking incubator에서 1시간동안 둔다. 그리고 5000rpm에서 3분간 원심분리를 하고 cell pell.. Biology/분자생물학 2021. 3. 21. 분자생물학실험 | E-coli Plasmid DNA 정제 플라스미드(plasmid) 플라스미드는 외부염색체 DNA분자를 작은 염색체로 전이 이동시키는 것이다. 정의에 따라 플라스미드는 복제단위(replicon)로써 외부염색체 상태에서 안정적으로 유전되는(특별한 분리 없이 유지되는)물질 이다. 전부는 아니지만 대개의 플라스미드는 세포의 생존에 꼭 필수적인 것은 아니다. 그러나 항생제가 존재하는 여러 경우에서는 생존에 필수적인 존재가 되기도 한다. 플라스미드의 기본적 특징은 다음과 같다. 1) 세포내에서 염색체와는 독립적으로 존재하는 환상의 DNA이다. 2) 세균의 항생제에 대한 저항성은 세균이 갖고 있는 플라스미드에 기인된다. (선발표지로 이용된다.) 3) 모든 플라스미드는 복제 개시점(origin of replication)이 될 수있는 적어도 한 개의 DNA.. Biology/분자생물학 2021. 3. 14. 분자생물학실험 | Scalp와 Skin에서의 미생물 DNA 추출 그리고 NGS를 통한 미생물 분석 성공적으로 DNA를 만드는 것은 더 이상의 농축이 필요 없는 아주 진한 농도의 DNA 용액을 얻는 것이다. 그렇지만, 때때로 희석용액이 얻어지기 때문에 DNA 농도를 증가시키는 방법을 고려하는것이 중요하다. 가장 널리 사용되는 농축 방법은 에탄올 침전법(Ethanol precipitation)이다. 염 존재하에서, -20나 그 이하의 온도에서 무수 에탄올은 고분자 핵산을 효과적으로 침전시킨다. DNA의 농축용액에서는 에탄올이 샘플의 위층에 놀이게 되어, 분자들이 두 층 사이에 침전된다. 에탄올이 묽은 DNA 용액과 섞여질 때는 침전이 원심분리에 의해 모아질 수 있으며 적당한 부피의 물에 재용해될 수 있다. 에탄올 침전법은 용액에 짧은 길이와 단량체 핵산 성분을 남게하는 잇점이 추가로 있다. 그러므로 ri.. Biology/분자생물학 2021. 3. 14. 분자생물학실험 | 재조합 단백질 Taq DNA polymerase 발현, 정제 및 확인 실험 방법 1. 재조합 단백질 Taq DNA polymerase 발현 Ampicillin 배지 뒷면에 cell 이름, streaking한 날짜, 본인 이름 등을 써주고 여기에 streaking을 할 Cell stock을 얼음에 가져온다. 팁 끝을 살짝 알코올램프에 대어 주고 식힌 뒤 cell stock을 조금 묻혀 배지에 streaking 한다. 37℃ incubator에 streaking한 LB plate를 뒤집어 넣어 하루간 키운다. 그 다음날 plate를 꺼내 inoc㎕ation과정을 거쳐준다. 먼저 Conical tube에 라벨링을 해주고 (LB AMP 50㎖) LB 50㎖에 맞춰 항생제를 50㎍/㎖가 되게 넣고 위 아래로 흔든다. 그리고 유리실험관에 LB를 6㎖씩 분주해 줍니다. (총 4개) 하.. Biology/분자생물학 2021. 3. 8. 분자생물학개론 | Edman degradation TIP 1. Edman Sequencing의 개요 2. 왜 Edman Sequencing 이 분석과정에 필요한가? 3. Edman degradation 실험 과정 4. Edman Protein Sequencing의 분석에서의 장점 5. Edman Protein Sequencing 의 분석에서의 단점 6. Edman Sequencing에 단백질 분자량에 따른 필요한 단백질 양 7. N-terminal Blocking에 영향을 주는 아미노산 8. PVDF membrane blotting시 - MeOH의 적정 농도 9. Sequencing 분석 결과가 나오지 않을 때, 고려해야할 몇가지 사항 펩타이드나 단백질의 N-말단 아미노산을 결정하는 방법으로 N-말단을 페닐 아이소사이아네이트(C6H5N=C=S)로서 처리.. Biology/분자생물학 2020. 10. 21. 분자생물학실험 | RNA의 추출과 정량 TIP 1. DNA 및 RNA의 구성성분의 차이점은 DNA는 thymine 및 deoxynibose를 함유하고, RNA는 uracil 및 ribose를 함유하고 있는 점이다. 2. 본 실험은 DNA, RNA를 각각 추출하고, UV를 통해 정량해 보았다. 3. 또 RNA는 RNA northern을 이용해 확인해 보았다. 실험 방법 1. RNA 추출 1) Mouse를 경추탈골(cervical dislocation) 시킨 후 간을 꺼낸다. 2) 무게를 재어 50mg 씩 2㎖ tube에 나눠 넣는다. 3) Polytron을 이용하여 간을 잘게 부순다. 4) TRIzol reagent 1㎖을 가하고 실온에서 5분간 방치한다. 5) Chloroform 0.2㎖(/1㎖ TRIzol)을 가하고 45초간 강하게 흔든다... Biology/분자생물학 2020. 10. 5. 분자생물학실험 | Western blotting Western blot은 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정단백질을 찾아내는 기법으로서 찾고자 하는 단백질에 대한 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 일으킴으로써 특정단백질의 존재여부를 밝혀낸다. 특정 단백질을 찾기 위해서 먼저 gel electrophoresis를 이용하여 크기별로 분리해낸다. 단백질을 순수하게 크기별로 분리해 내기 위해서는 단백질의 단위 질량당 charge와 3차원 folding 구조를 모두 같게 해줘야 한다. 이런 이유로, 단백질은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro phoresis)를 수행한다. 이는, SDS를 detergent로서 이용하여 단백질을 모두 단위 질량당 같은 정도의 negative charge를 띠.. Biology/분자생물학 2020. 4. 24. 분자생물학실험 | Animal Cell Culture, Cell lysis, and Protein Quantification 실험기본장치들에 대한 이해, 세포배양, 그리고 gene과 관련한 실험을 진행해본 경험을 토대로, 특정 gene을 E.coli에 translation시켜, target gene을 복제함을 배웠다. 이 gene을 2가지 실험 방법으로 활용할 수 있음을 알 수 있다. 첫번째로는, gene 자체로만 활용하는 것이다. 그것이 바로, plasmid DNA Isolation이다. 두번째로는, gene에 의해 발현된 protein을 활용하는 것이다. 본 실험은 이와 연관된 protein isolation을 다룬다. 그리고, 추가적으로 standard curve를 이용하여 protein의 농도를 측정하는 방법도 배울 것이다. 실험 방법 1. 실험 과정 1) Plate위에 있는 cell에 RIPA buffer을 p200 .. Biology/분자생물학 2020. 4. 4. 분자생물학실험 | DNA 서열 구분 TIP 본 실험에서는 DNA 서열 안에 어떤 서열과 정보가 담겨있는지 알아내는 과정이다. 생물 정보학 생물 정보학이란 분자생물학분야에 컴퓨터과학을 적용한 학문이다. 일반적으로 DNA와 단백질 서열의 분석과 서로 다른 서열의 비교를 위한 정렬, 단백질 3차 구조를 만들어 보여준다. 특히 대량의 DNA 서열분석에 이용되고 있다. 수많은 생물의 정보 중에 필요한 정보를 얻어 내는 기술은 아주 유용하다. 예를 들면, 감기에 걸렸는데 감기를 낫게 해줄 약이 필요합니다. 하지만 많은 생물 중에 어떤 것이 감기를 낫게 해주는 것인지 모르지요. 이 때 생물 정보학이 사용됩니다. 많은 데이터 중에 필요한 정보를 뽑아 줍니다. 우리는 그 정보를 가지고 임상실험을 해본 후 약을 만들고 병을 낫게 해줍니다. Central D.. Biology/분자생물학 2020. 3. 31. 분자생물학실험 | Protein assay and Western blot TIP 1. Protein assay : Cell에서 protein을 추출하는 과정을 이해하고, protein assay(BCA method)을 이용하여 단백질의 함량을 측정할 수 있음을 이해한다. 2. Western blot : Protein sample을 membrane에 transfer하고, Western blot을 통하여 항원-항체 반응을 유도하여 원하는 특정 단백질을 detection 할 수 있음을 이해한다. 실험 방법 1. 실험 과정 1) 10% SDS gel 만들기 2) Protein assay ① Standard curve (BSA + DW + BCA solution) ② BCA solution = BCA : Cu++ = 50 : 1 ③ Sample (Protein + DW + BCA so.. Biology/분자생물학 2020. 3. 24. 이전 1 2 3 다음 반응형
