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소박한 실험 노트 - 종합편

생화학실험 | 형질 전환 실험 개요 형질전환이란 외부에서 만들어진 plasmid를 plasmid가 없는 원핵 세포 cell에 넣어 그 원핵 세포가 본래 성질과는 다른 새로운 유전형질을 나타내게 하여 삽입한 plasmid를 대량으로 키우는 과정이다. 형질전환은 폐렴구균을 통해 DNA가 유전물질임을 PCR과 클로닝 등의 방법으로 증명했다. 인슐린의 경우 처음에는 돼지에게서 추출했지만 많은 수요에 비해 공급은 원활하지 못 했고 깨끗하지 않을 수도 있다는 의견 때문에 중지되었다. 그 후, 인간에게서 인슐린을 만드는 단백질(염기서열)을 찾아내어 인슐린을 공급할 방법을 개발해내었다. 형질전환에서 가장 필요한 것은 제한효소이다. 제한효소는 하등한 원핵세포들이 면역 작용을 하기 위해 가지고 있는 효소로 한 제한효소는 한 특정 염기서열을 잘라내.. Biology/생화학 2023. 10. 25.

생화학실험 | 단백질 분리정제 및 기능분석 - buffer 만들기 TIP 1M의 Tris-HCl (pH7.4), NaCl, MgSO4, Stock solution 을 제조한 후 다양한 NaCl 농도의 elution buffer 를 만든다. DEAE sepharose anion exchange chromatography 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)법은 주어진 pH에서 단백질이 가지는 알짜 전하(net electric charge)의 하전성과 전하량의 차이에 의해 분리하는 방법이다. 관 속의 기질은 합성 중합체(수지,resin)로서 전하를 띤 기를 가지고 있는데; 양이온 기를 가지는 경우 양이온 교환체(cation exchanger)라고 부르며, 음이온 기를 가지는 경우 음이온 교환체(anion exchanger)라고 부른다.. Biology/생화학 2023. 4. 11.

생화학실험 | 단백질의 정량분석 TIP Lowry method와 Bradford method를 사용하여 단백질(protein)의 농도를 측정한다. 단백질의 정량 시료 내에 포함된 단백질의 양, 또는 농도를 구하는 과정으로 280 ㎚에서 흡광도를 측정하는 방법과 단백질의 농도에 따른 색의 변화를 이용하여 분석하는 방법이 있다. 색의 변화를 이용하는 비색정량분석 (colormetric analysis)에는 Bradford법, Biuret법, Lowry법, Bicinchoninic acid법 등이 있다. 280 ㎚의 파장에서의 흡광도 측정 방법은 tyrosine이나 tryptophan 잔기의 흡광도를 측정하는 방법으로 장점으로는 분석이 빠른 것을 들 수 있으며, 단점으로는 tryptophan의 함량 변화에 따라 흡광도가 틀려지고 같은 파장의.. Biology/생화학 2023. 3. 30.

생화학실험 | 단백질 정량(Lowry 법) TIP 어수리의 추출 희석액으로부터 어수리의 단백질을 Lowry법으로 정량한다. Lowry법 알칼리성에서 단백질의 peptide 결합과 구리가 반응하여 Cu2+이온을 생성하는 Biuret 반응의 원리를 이용한 것이다. 발색의 정확한 기작은 밝혀지지 않았지만 Cu2+ 이온은 방향족 아미노산의 산화를 유도하여 phospomolybdotungstate를 푸른색의 heteropolymolybdnum으로 환원시킨다. 이러한 반응 결과 강한 푸른색을 생성하며 그 강도는 tryptophan과 lysine양에 영향을 받는다. 이 방법은 단백질의 농도가 0.01～1.0㎎/㎖의 경우에 측정가능하다. 실험 방법 1. 실험 과정 1) 교반 추출액(10000ppm 용액)을 1000ppm으로 희석하여 마이크로튜브에 넣고 Vort.. Biology/생화학 2023. 3. 24.

생화학실험 | PCR과 전기영동 TIP PCR은 아주 소량의 시료로도 우리가 원하는 DNA 서열을 엄청난 양과 높은 정확도로 증폭시킬 수 있다. 전기영동은 전하를 띤 분자화합물에 일정한 전압을 걸어주어 분자량, 전하량등의 물리화학적 성질의 차이에 따라 분리시키는 방법이다. PCR 정의 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응)이란 DNA polymerase를 이용하여 원하는 부위의 DNA를 선택적으로 대량 복제 하는 방법이다. 1983년 PCR이 고안되어 적은 양으로 존재하는 DNA서열 탐지와 cloning이 가능하게 되었다. 방법은 표적 DNA서열의 증폭(amplification)에 기초를 두고 있다. 증폭하고자 하는 DNA내 표적 strand 3' 말단에 상보적인 두 개의 특정 oligonucleot.. Biology/생화학 2022. 10. 5.

생화학실험 | Polyacrylamide Gel Electrophoresis TIP 폴리아크릴아미드 젤 영동법에 대해 알고, 만드는 방법을 익힌 후 PCR을 통하여 밴드를 비교해본다. PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)는 Acrylamide와 bis-acrylamide를 중합시켜서 형성된 gel을 이용하여 전기영동을 하는 것으로, 단백질 입자가 acrylamide의 공극 사이를 지나가게 됨으로써 입자가 큰 것은 진행속도가 더디고, 입자가 작은 것은 진행 속도가 빠르게 되며, 같은 크기의 이바이면 하전량이 많은 것이 더 빨리 이동하게 되는 원리를 이용하여 일정시간 동안 움직인 거리에 의해 단백질 종류를 구분하는 방법이다. SDC 등을 사용하지 않으므로 nondenaturing gel electrophoresis 또는 native gel elec.. Biology/생화학 2022. 9. 30.

생화학실험 | RNA 추출 & cDNA 합성 TIP 세포에서 직접 RNA를 추출하여 보고, 추출된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하여 RT-PCR을 통해 특정 유전자의 mRNA 발현량을 비교한다. Chloroform의 역할 RNA extraction을 할 때 페놀계열 lysis buffer를 쓰게 되는데, 이후 chloroform을 넣어줌으로써 RNA가 녹아있는 수층의 페놀을 제거하여 RNA의 순도를 높여준다. pH4 정도로 낮을 때 RNA는 물과 함께 섞여있으므로 물에 남아있을 수 있는 페놀을 chloroform에 녹아들게끔 해주는 것이다. 또한 chloroform은 비극성용매여서 물에 잘 녹지 않으므로 층분리가 이루어지게 된다. 실험 방법 1. RNA extraction 1) 500㎕ RiboEx를 넣은 sample에 chloroform 10.. Biology/생화학 2022. 9. 4.

생화학실험 | α-glucosidase 저해 평가 TIP α-glucosidase를 억제하면 빵, 감자, 파스타와 같은 녹말이 장에서 분해되는 것을 막아준다. 즉, 식사 후에 혈당이 증가하는 것을 늦추어 혈당을 낮추는데 도움을 준다. 그러므로 당뇨병이 있는 경우 약물로 사용할 수 있다. 실험을 통해 분광광도계를 이용한 α-glucosidase의 저해를 측정한다. α-글루코시다제(α-glucosidase) 글루코시드 가수분해 효소를 가리킨다. 비환원 말단에 존재하는 α-D-글루코시드 결합을 가수분해하여 α-형 글루코오스를 생성하는 효소의 총칭. 단순히 글루코시다이제라고 불리는 경우도 있다. 동물, 식물. 미생물계에 널리 분포한다. 아밀라아제의 작용으로 생긴 올리고당의 글루코오스에의 분해와 배당체의 분해에 중요한 역할을 한다. 배당체와 글루코시드 결합의 종.. Biology/생화학 2021. 7. 22.

생화학실험 | Elastase 저해 활성 평가 TIP 펩타이드는 단백질 성분으로, 길고 짧은 아미노산으로 구성되어 있다. 단백질층을 쌓아주는 역할을 한다. 대부분의 펩타이드는 수분 결합(수분을 끌어들이는) 기능을 한다. 그리고 이론적으로는 피부 손상을 복구하라고 명령하는 세포 대화 성분이다. 이러한 이유로 주름개선효과를 내고 싶다면 펩타이드의 분열을 저해해야 한다. 펩타이드의 분열을 저해하는 방법 중 하나는 펩타이드 결합의 분열하는 과정에서 촉매역할을 하는 효소인 Elastase를 저해하는 것이다. 실험을 통해 분광광도계를 이용한 Elastase 활성 저해를 측정한다. 엘라스틴(Elastin) 엘라스틴은 콜라겐과 함께 결합조직에 존재하고 고무탄력성과 같은 신축성이 있는 단백질이며 조직의 유연성, 신축성에 관여하고 있다. 따라서 신축이 항상 반복되는 .. Biology/생화학 2021. 7. 21.

생화학실험 | DPPH 소거능 TIP 인간을 포함한 생물은 호흡이라는 과정을 통해 ATP 등의 에너지를 얻는다. 이러한 과정에 필연적으로 흡입된 산소의 2%를 활성산소로 변환시켜 지니게 되고 이 활성산소는 Free radical을 가진 산소를 의미한다. free radical은 세포막 산화, 촉진, 노화, DNA 변형 등의 문제를 야기한다. 실험을 통해 분광광도계를 이용한 free radical 소거능력을 측정한다. DPPH (2,2-diphenyl hydrazy)는 안정한 유리기(stable free radical)로서, 분자 내 비공유 전자(N∙)를 갖고 있으나 전자나 free radical과 반응하면 안정한 구조 (N-H)로 변한다. DDPH는 수용액 상태에서 보라색이지만, free radical이 소거되면 전자공여능(elect.. Biology/생화학 2021. 7. 20.

생화학실험 | ABTS 라디칼 소거능 TIP 인간을 포함한 생물은 호흡이라는 과정을 통해 ATP 등의 에너지를 얻는다. 이러한 과정에 필연적으로 흡입된 산소의 2%를 활성산소로 변환시켜 지니게 되고 이 활성산소는 Free radical을 가진 산소를 의미한다. free radical은 세포막 산화, 촉진, 노화, DNA 변형 등의 문제를 야기한다. 실험을 통해 분광광도계를 이용한 free radical 소거능력을 측정한다. 항산화제(Antioxidant) 항산화제는 산화를 방지하는 물질을 총칭하여 일컫는 말이다. 생체 내에서의 산화 반응은 주로 라디칼이 관여하는 연쇄 반응(chain reaction)을 통해서 이루어지며, 궁극적으로는 세포에 피해를 주게 된다. 싸이올(thiol)이나 아스코르브산(ascorbic acid, 비타민 C)과 같은.. Biology/생화학 2021. 7. 19.

생화학실험 | DPPH를 이용한 항산화 테스트 TIP 일상생활에서 사용하는 물질을 DPPH용액을 이용하여 항산화 능력을 테스트해보고 비교해보기 활성산소 활성산소는 산소 원자를 포함한, 화학적으로 반응성 있는 분자로 반응성이 강하고 다른 유기물과 반응하는 물질이다. 생물체내에서 생성되는 산소의 화합물로 생체 조직을 공격하고 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소이다. 산소가 4개의 전자를 받으면서 독성이 없는 H2O를 만드는 도중에 생겨나는 부산물이다. 반응성이 높은 활성산소는 세포에 독성을 일으킬 수 있지만, 건강한 정상 세포 내에서는 대부분 분해되어 제거된다. 세포 내에서 ROS는 생성과 소멸의 균형에 의하여 일정 소량의 활성산소의 양이 존재하고, 이를 통해서 생리현상을 유도한다. 활성산소의 농도는 자외선이나 높은 열에 노출되는 것처럼 환경적인 스트.. Biology/생화학 2021. 7. 19.

생화학실험 | Tyrosinase 활성 저해 TIP 인간의 피부색은 멜라닌의 양에 의해서 결정된다. 멜라닌의 양이 많을수록 검은색 피부를 띤다. 이러한 이유로 미백효과를 내고 싶다면 멜라닌의 합성을 저해해야 한다. 멜라닌의 합성을 저해하는 방법 중 하나는 Tyrosine을 산화하여 멜라닌을 생성하는 효소인 Tyrosinase를 저해하는 것이다. 실험을 통해 분광광도계를 이용한 Tyrosinase 활성 저해를 측정한다. Tyrosinase는 Tyrosine을 산소가 존재하는 곳에서 산화하여 멜라닌을 생성하는 효소이다. 그러므로 Tyrosinase의 활성을 저해시키면 멜라닌 생성이 억제된다. Tyrosinase를 통해 Tyrosine이 산화되면서 주황색을 띠지만, Tyrosinase 활성이 저해되면 Tyrosinase을 통한 Tyrosine의 산화반응.. Biology/생화학 2021. 7. 10.

생화학실험 | BCA 분석법 BCA분석법은 비색정량법의 일종으로 시료액 중의 아미노산과 시약의 반응에 의한 발색을 비색하여 목적으로 하는 화합물을 정량 하는 분석법으로 20가지 종류의 아미노산 중에 대표라고 할 수 있는 Cysteine(시스테인) 을 사용합니다. BCA분석법에서 사용되는 녹색의 발색시약은 시료액 속에 아미노산이 포함되어있을 경우 보라색으로 변색하며 시료액 속에 아미노산의 농도가 높을수록 더욱 진한 보라색이 됩니다. BCA(Bicinchoninicacid) ① BCA assay는 Bicinchoninicacid에서 나온 말이고, Pierce방식이라고도 한다. ② 단백질의 양이 많으면 보다 많은 보라빛화합물이 생성 → 그 화합물은 빛을 더 많이 흡수. 즉 흡수율이 증가→그것에 비례해서 Sample에 있는 단백질 양을 결.. Biology/생화학 2021. 5. 26.

생화학실험 | 아미노산의 정성분석과 단백질의 정량 분석 아미노산 (Amino acid) 단백질을 염산과 함께 가열하면 여러 가지 아미노산의 혼합물질이 얻어진다. 이러한 아미노산의 혼합물에서 각각의 아미노산을 분리하는 방법은 Emil Fischer에 의해서 개발되었고, 현재는 최소한 25종이 분리되었다. 결국 단백질은 이러한 아미노산으로 구성되어 있다. 아미노산은 화학적으로 정확하게 표현한다면 아미노알칸산(amino alkanoic acid)이며, 분자구조에 아미노기(-NH2)와 카르복실기(-COOH)를 갖고 있으며, 카르복실기에 대해서 α위치에 아미노기가 결합된 것을 α아미노산(α-amino acid), β위치인 경우는 β아미노산(β-amino acid), γ위치의 경우는 γ아미노산(γ-amino acid)라고 한다. 한편, 단백질을 가수분해하여 생성되는 아.. Biology/생화학 2020. 12. 13.

생화학개론 | TCA 회로 - 크렙스회로(시트르산회로) TIP 1. Acetyl-CoA 생성과 처리 2 TCA 회로의 반응과정과 에너지 수지 3 TCA 회로의 생리적 의의 TCA 회로의 생리적 의의 TCA 회로에서는 다량의 ATP가 얻어지므로 연료물질의 산화로 필요한 에너지를 공급하는 것이 중요한 생리적 기능이다. 이러한 분해대사로서의 의의와 아울러 TCA 회로의 중간물질들은 여러 아미노산으로부터 형성되고 oxaloacetate를 거쳐 glucose 합성에 이용될 수 있게 하므로 합성적 측면에서도 중요한 기능을 발휘한다. 일부 아미노산의 분해로 생성된 fumarate는 oxaloacetate가 되어 glucose로 전환될 수 있으므로 TCA 회로는 당신생합성에도 관여한다. 또한 중간물질인 α-ketoglutarate나 oxaloacetate는 아미노기 전이반.. Biology/생화학 2020. 12. 7.

생화학실험 | Plasmid DNA isolation from bacterial cell - miniprep 실험 방법 1. 실험 과정 1) 미리 배양한 대장균 (E.coli) 세포 1.9㎖을 2㎖ tube에 넣고 13,000rpm으로 10분간 원심분리 한 후 상등액은 버린다. 2) 남은 용액은 Micro pipette으로 제거하고 Cell 덩어리를 얻는다. 이때 배지 성분이 남아있지 않도록 pipette으로 배지를 완전히 제거한다. 3) Cell이 들어있는 2㎖ tube에 S1 solution 250㎕을 넣고 pipetting한다. 4) S2 solution 250㎕을 넣고 조심스럽게 3～4번 inverting을하고 2분간 방치한다. 5) S3 solution 350㎕ 조심스럽게 inverting 한다. 6) 10분간 원심분리 한 후 plasmid purification tube에 상등액을 붓는다. 이때 pi.. Biology/생화학 2020. 9. 5.

생화학실험 | His–Tag 단백질의 정제 - Purification of His-tagged proteins TIP 1. 단백질을 정제하는 목적 1) 가능한 최고의 회수율 2) 최고의 생물학적 활성 유지 3) 최고의 순도 His-tag 단백질 / Ni-NTA 현재 재조합 단백질을 정제하는데 가장 많이 사용되는 방법이다. 다시말하면, 단백질을 구성하는 아미노산 중 히스티딘이 금속 이온과의 배위 결합에 강하게 관여한다는 연구 결과가 있다. 6개(혹은8개)의 His을 연속으로 달아놓으면 Ni등의 금속이온과 배위결합을 생성한다. Ni이 레진에 결합되어 있으면 His을 달아 Ni결합 레진에 단백질이 달라붙는데(Ni고정-NTA사용)이런 성질을 이용해 단백질을 정제한다. 따라서 유전자 공학적으로 단백질의 말단에 다수의 히스티딘을 첨가하면 단백질의 금속 이온 친 화성이 현저히 증가하여 쉽게 정제가 가능하다. 히스태그를 갖는 .. Biology/생화학 2020. 7. 5.

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