일반생물학실험 | Southern blotting

TIP

 

 

Rice tissue로부터 genomic DNA를 추출하여 전기 영동한 후 southern blotting한다. probe와 hybridization 하여 특정 DNA의 존재유무와 정량을 알아본다.

 

 

 

Southern blot

1975년에 DNA 조각을 전기 영동하여 분리한 후 nitrocell㎕ose filter에 옮겨서 특정DNA 조각을 확인하는 실험 기법이 southern에 의해 개발되었다.

 

 

Blotting 또는 hybridization이란 한 가닥으로 된 핵산이 이와 상보적인 염기 서열의 또 다른 한 가닥의 핵산과 적당한 조건에서 만나게 되면 이중나선을 형성하는 현상을 말한다.

 

Southern hybridization은 위의 현상을 이용하는 기법으로, 먼저 genomic DNA을 적당한 restriction enzyme으로 처리한 후 agarose gel 상에서 전기 영동하여 크기별로 DNA조각을 분리한다. gel 상에서 이중 나선 상태로 있는 DNA를 alkali로 단일 가닥 상태로 만들어준 뒤 solid support(흔히 nitrocell㎕ose 혹은 nylon membrane)로 옮긴다. 이 때 gel 상에서의 DNA 위치가 변하지 않고 membrane으로 옮겨지게 된다.

 

Gel 상에서 filter로 DNA를 옮기는 방법은 capillary transfer에서는 흡습지에 의해 transfer buffer가 모세관 현상으로 DNA와 함께 이동할 때 DNA는 그 중간에 있는 membrane에 걸려 붙게 된다. Membrane으로 옮겨진 DNA는 완전히 고정된 상태가 아니고 그물망에 엉겨 붙어있는 정도이므로 UV를 쬐어줌으로 membrane에 고정시킨다. Membrane에 고정된 여러 종류의 DNA는 동위원소 또는 형광물질 등으로 표지된 probe들과 hybridization 되면서 특정 DNA의 존재유무와 정량까지 알아낼 수 있게 해준다. Southern Hybridization을 간단히 정리하면 핵산분리하고 제한효소 처리 후 agarose전기 영동한다. gel 전 처리하고 southern blot한다. 그 후 Hybridization하고 detection한다.

 

 

실험 방법

1. Extraction

1) Grind tissue in liquid nitrogen with a mortar and pestle. Transfer the sample to 1. 5㎖ e-tube. [Up to 500㎕(=0.25g)line]

2) Add 400㎕ DNAzol ES to each tube. And store the sample for at least one week at RT with mixing by inversion or mechanical rotation ( slowly rotated 5-20RPM). Do not vortex.

3) Add equal volum(400㎕) of Chloroform. And store the sample for 5min at RT with mixing by inversion or mechanical rotation. Do not vortex.

4) Centrif㎍e at 12,000g for 10 min at RT.

 

2. DNA Precipitation

1) Transfer the aqueous phase to new tube (about 450㎕).

2) Add 0.75 volum(340㎕) of EtOH. Mix by inverting 8-10times and store at RT for 5 min.

3) Centrif㎍e at 5,000g for min at RT. And discard the res㎕ting supernatant.

 

3. DNA Wash : prepare the DNAzol ES-ethanol wash solution → DNAzol ES : EtOH= 1:0.75=4:3

1) Resuspend the pellet in 100㎕ of EDTA(1-10mM, pH 7-8).

2) Do repeated pipetting. To completely remove RNA from the isolated DNA add 50-100㎍ of RNase A(5㎕ of 10㎍/㎕ stock) to the EDTA suspension and incubate samples for 15 min at RT.

3) Centrif㎍e at 12,000g for 7 min at RT. Transfer the supernatant to a clean tube.

4) Add 600㎕ (5-10 volumes) of DNAzol ES-ethanol wash solution.

5) Centrif㎍e at 5,000g for 4 min at RT. And discard the res㎕ting supernatant.

6) Add 1.5㎖ of 75% EtOH. Wash the DNA pellet by inverting(25RPM for 5min).

7) Centrif㎍e at 5,000g for 4min at RT. And discard the res㎕ting supernatant. Remove excess EtOH from the DNA pellet with a micropipette. Do not dry.

 

4. DNA Solubilization

1) Resuspend the pellet in 52㎕ of 8mM 증류수(120㎕ of 100mM 증류수 + 1380㎕ of ddH20=1.5㎖).Do slowly pipetting.

2) Centrif㎍e at 12,000g for 4 min at RT. And the 50㎕ of aqueous phase the new 1.5㎖ tube.

3) Add 1/10 volume(5㎕) of 0.1M HEPES buffer per the aqueous phase. → Final pH 8.0

 

5. 전기영동(Electrophoresis)

1) agarose gel 만들기

2) 1% (W/V)전후로 만듭니다.

3) TAE buffer 50㎖dp와 agarose powder 0.5g를 약 2분정도 전자렌즈에 돌려 녹인다.

4) 굳기전에 EtBr과 1)을 gel cast에 부어 넣습니다.

5) gel loading buffer와 추출한 genomic DNA를 pipet으로 잘 섞어서 gel 판에 comb으 로 만들어진 홈에 잘 넣습니다.

6) 10분동안 electrophoresis를 한다.

 

5. southern blotting

1) 각 제한효소의 조합당 5㎕ of gDNA/1 reaction을 사용한다.

2) Total volum of enzyme digestion take 20～25㎕ per one reaction(gel에 loading할 때 볼륨이 적어야 band의 퍼짐 현상을 최소화할 수 있다. plasmid DNA도 digestion)

3) 제한효소 15～20 unit을 넣고 1차 37° water bath, 2hour 반응시킨 후, 37° incubator overnight 반응시킨다. 30℃반응은 Heat block에서 overnight. → 2시간만 반응시킨다.

 

6. Electrophoresis

1) Prepare 1% agarose gel.(500㎖ 0.5X TAE buffer + 5g agarose 녹인 후, Etbr 25㎕ 넣음. Loading 두어 시간 전에 미리 만들어 충분히 식힌다. 얇은 36- well comb 이용)

2) Loading

① λDNA BstEⅡ Marker는 10 ng을 loading한다. eg) 5㎕ of 100 ng/㎕ Marker DNA + 85 ㎕ of ddH₂O + 10㎕ of 10x dye = 100㎕ of 5ng/㎕

② 양쪽은 하나 혹은 둘 정도 well을 비워 loading dyeaks loading한다. (오랜시간 separation으로 인하여 발생할 수 있는 전체적인 휘어짐 방지)

③ Load 40V for overnight (13～16hrs).

 

7. Membrane blotting

1) After electrophoresis cut the gel corret size(maker쪽 귀퉁이 잘라서 상하좌우 표시)

2) Take a picture and save.

3) Depurination : Shake gently the gel with 0.25M HCl for 15min(Dye color Blue→ Yellow)

4) Rinse the gel slices with d once.

5) Alkalization(phosphodiester bond breakage); Shake gently the gel with d once.

6) Transfer within 20X SSC for overnight

7) Blotting이 끝나면, UV 램프에서 gel&membrane 확인한다.

8) UV cross-linkage of membrane for 5min. Air- dry and store at room temperature.

 

8. probe 제작

1) enzyme 처리하기

2) gel loading 하고 Elution 하기.

 

9. Hybridization buffer

1) prehybridization

2) Making Labeling probe

3) Hybridization

4) Washing

5) Exposure

 

 

 

Southern blotting 레포트