액체에 용해되어 있는 혼합물의 각각의 분자량의 차이를 이용해서 분리하는 방법 중 대표적인 방법은 다공성 입자를 충진한 column을 이용하는 것이다. 아래 그림과 같이 여러 가지 분자량을 가진 용질이 용해되어 있는 용액을 충진 column의 윗부분에 투입한 후 용질이 함유되어 있지 않은 용매만을 coulmn에 공급하면 분자량이 큰 물질은 충진물질의 공극을 통과하지 않고 입자사이로 빠져나오게 되므로 column을 통과하는 시간이 빠르다. 반면에 분자량이 작은 물질은 입자의 공극을 돌아다니다가 빠져나오게 되므로 column을 통과하는 시간이 오래 걸린다. 이러한 분자량과 column의 통과시간 사이의 관계를 이용하면 시료의 분자량을 측정할 수 있게된다.
Column을 통과한 단백질용액을 일정한 부피씩 분취기 (Fraction Collector)로 받아내는 동시에 용액의 흡광도를 280㎚에서 측정하면 된다. 이 실험은 BSA (Bovine Serum Albumin), IgG (I㎜unoglobulin G), cytochrome C, beta-lactogrobulin, cytidine등 분자량이 서로 다른 단백질 용질을 함유하고 있는 용액을 column을 통과한 후 용액의 흡광도와 통과 부피와의 관계를 나타낸 것이다. 각 용질 단백질들이 분자량이 큰 물질부터 column을 빠져아오는 것을 알 수 있다.
GPC
GPC는 다공성 입자를 충진한 column을 이용하여 액체에 용해되어 있는 혼합물의 각각의 분자량 차이를 이용해서 분리하는 방법 중 대표적인 방법이다. 고분자의 분자량(M.W.)과 분자량 분포(MWD)를 결정하는 가장 기본적인 방법으로서 용출법에 의한 액상-고상형의 액체 크로마토크래피의 일종으로 이미 분자량을 알고 있는 표준 시료(standard sample)와 비교하여 새로운 시료(unknown sample)의 상대 평균 분자량과 분자량의 분포를 결정하는데 사용된다.
실험 방법
1. FPLC 실험조건
1) Eluent: 0.05 M sodium phosphate buffer, 0.15 M NaCl, pH 7.0
2) Flow Rate: 0.8 ㎖/min
3) Detector: UV 280 ㎚
2. 실험 과정
1) FPLC를 작동시킨고 eluent를 0.8 ㎖/min로 공급한다.
2) Detector의 파장을 280 ㎚로 조정한다.
3) 표준시료 450 ㎕를 column에 주입한다.
4) Eluent의 부피에 대한 용액의 흡광도를 측정한다.
5) 실험시료 450 ㎕를 column에 주입한다.
6) 흡광도의 peak에 해당하는 부피를 측정한다.
[생화학실험]GPC 기법을 이용한 단백질 분리 및 미지시료의 분자량 측정 레포트
1. 실험 목적 가. 실험 목표 액체에 용해되어 있는 혼합물의 각각의 분자량의 차이를 이용해서 분리하는 방법 중 대표적인 방법은 다공성 입자를 충진한 column을 이용하는 것이다. 아래 그림과 같이 여러 가지 분자량을 가진 용질이 용해되어 있는 용액을 충진 column의 윗부분에 투입한 후 용질이 함유되어 있지 않은 용매만을 coulmn에 공급하면 분자량이 큰 물질은 충진물질의 공극을 통과하지 않고 입자사이로 빠져나오게 되므로 column을 통과하는 시
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