생명공학실험 | 미지 세균 동정 - Biooxidation and Hydrolysis

 

 

 

TIP

 

 

1. 미지세균 동정 : 대상 미생물들의 형태적(배양학적) 그리고 생리적 특성들에 대한 정보를 수집하여, 미지의 미생물 동정에 필요한 독립적인 연구를 이해한다.
2. LC-ESI-IT-MS : 특정대사물의 분리 분석 기술인 LC/MS에 대하여 이해하고 실험값(MS)을 바탕으로 구조와 MW를 유추해 본다.

 

 

 

배지의 종류

Ⅰ. 성분에 따른 분류

① 천연배지(natural medium) : 배지 중의 영양분이 모두 천연물인 동·식물체에서 얻어진 것으로, 충분한 영양분은 함유하고 있으나 그 화학조성이 복잡하고 각 성분의 양 및 종류 등을 정확하게 표시할 수 없는 것으로 미생물의 증식 및 분리 배양에 쓰인다.

 

② 합성배지(synthetic medium) : 화학적 성분이 분명한 순수한 물질을 일정량 혼합하여 만든 것으로 구성 성분의 화학적 조성 및 양을 정확하게 알 수 있다. 미생물의 생화학적 성상, 균체 성분, 미생물의 대사 및 유전 연구 등에 쓰이며 최소영양배지라 한다.

 

Ⅱ. 물리적 성상에 따른 분류

① 액체배지(liquid medium, broth) : 배지 내에 agar를 첨가하지 않은 액체 상태의 배지로 미생물의 증식, 당 분해 시험, 미생물의 생화학적 성상 검사,대사산물의 검출 등에 사용된다.

 

② 고체배지(solid medium) : 액체배지에 배지의 고형화를 위해 agar를 첨가한 배지로 고체 상태이며 집락의 형태 관찰, pure culture의 분리 또는장기 보관에 이용된다.

ⓐ 평판배지(plate medium) : petri dish에 고체배지를 약 4㎜두께(15～20㎖)정도로 굳힌 것으로 미생물의 분리배양, 집락의 관찰, 용혈능 및 항생제 감수성 검사 등에 사용된다.

ⓑ 사면배지(slant medium) : 시험관에 고체배지를 약 30˚경사가 되게 하여 굳힌 것으로 호기성 미생물의 증식 및 보존, 세균의 생화학적 검사 등에 쓰인다.

ⓒ 고층배지(stab medium) : 시험관에 고체배지를 수직으로 세운 상태로 굳힌 것으로, 미호기성균이나 혐기성균의 배양, 균주의 보존, 세균의 운동성 시험 등에 사용된다.

 

③ 반고체배지(semisolid medium) : 젤리 같은 반고형상의 배지로 적은 양(0.3～0.5%)의 agar가 함유되며, 세균의 설탕 이용성이나 운동성을 관찰하는데 이용된다.

 

Ⅲ. 사용 목적에 따른 분류

① 증식배지(growth medium) : 여러 종류의 영양소를 적당량 함유한 배지로 미생물의 증식, 순수배양, 보존 등 일반적인 배양에 쓰인다.

 

② 증균배지(enrichment medium) : 많은 미생물이 혼합된 경우, 특정한 균종만을 다른 균종보다 빨리 증식시켜 분리 배양이 쉽게 되도록 한배지이다. 배지 내에 원하는 미생물의 증식을 촉진하는 물질과 원하지 않은 미생물을 억제시키는 물질이 포함되어 있다.

 

③ 선택배지(selective medium) : 두 종류 이상의 미생물이 혼합되어 있는 검체에서 원하는 미생물만을 선택적으로 분리 배양하는데 사용하는 배지로색소, 중금속, 화학약품, 항균제 등 원하지 않는 미생물의 증식을 억제하는 물질을 함유하고 있다.

 

④ 감별배지(differential medium) : 순수배양 된 미생물의 특정한 효소 반응을 정상적으로 확인하여 균종의 감별과 동정을 하기 위한 배지로 감별이 용이하도록 지시약 등의 화학 물질을 첨가한다.

 

⑤ 수송배지(transport medium) 또는 보존배지(preservative medium) : 분리 배양 하기 전까지 시간이 늦어지거나 검사 재료를 수송할 때 사용하는배지로 검사재료 중의 미생물이 너무 많이 증식하거나 사멸되지 않도록 만든 배지이다.

 

 

HPLC system Configuration

HPLC 시스템은 천연물을 비롯하여 식품, 농약, 생명공학, 신약개발 등 다양한 분야에서 가장 많이 사용되고 있다. HPLC를 이용한 분리분석의 기본적인 원리는 액체 크로마토그래피와 동일하며(크로마토그래피의 일종이고 이동상이 액체인 것을 말한다. 고정상으로서 각종 고체 또는 액체를 사용하고 시료를 적당한 전개제로 이동시켜, 시료중성분의 고정상에 대한 흡착성이나 분배계수의 차이에 따른 이동속도의 차를 이용해 이것을 분리하는 방법이다.

 

분리된 시료는 차동굴절계 또는 자외광도계에 의해 검출한다. 고정상에 따라서 분배, 흡착, 이온교환, 게르여과법 등으로 분류된다. 무기이온, 아미노산, 단백질 등의 정제나 정량에 유용한 방법이다. 최근에는 고속액체크로마토그래피가 출현하고 항생물질이나 항간질제, 디지탈리스 등의 혈중농도를 측정할 수 있다.)GC 시스템과 마찬가지로 고정상(stationary phase)과 시료(sample) 및 이동상(mobile phase)와의 상호작용이 시료 성분의 분리에 영향을 미치지만, 액체 크로마토그래피 시스템은 가스 크로마토그래피 시스템과는 달리 분석 가능한 분자량의 제한이 없다. 즉, HPLC 는 GC에 비해 비교적 분자량이 크거나 비-휘발성인 시료를 분석할 수 있으며, 분석한 시료의 회수가 가능하다는 장점이 있다.

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실험 방법

1. Oxidase & Catalase test

1) 슬라이드를 만들기 전에 실험대를 소독제로 닦아낸다.

 

2) 사용할 슬라이드를 알콜이나 흡수지 등으로 닦은 후 이물질을 제거.

 

3) loop로 균을 배지에서 꺼내 슬라이드글라스 위에 두 군데 도말한다.

 

4) 두 군데의 도말표본위에 각각 와 Kovacs시약을 한 두방울을 떨어트린다.

 

5) 관찰 결과를 분석하여 미지세균을 동정한다. [(A)의 정체규명]

 

2. LC/MS(실험 과정 생략)

주어진 Spectrum data와 fragment pattern을 보고 시료의 MW와 구조를 유추해 본다.

 

 

 

[생명공학실험]미지 세균 동정 레포트