일반생물학실험 | E.coli의 Transformation

 

 

 

TIP

 

 

E.coli의 trasformation 실험을 통해서 유전 공학에 많이 쓰이는 transformation의 기작을 이해하고, 그 방법을 익힌다.

 

 

 

Plasmid

Plasmid는 원형의 double-stranded DNA로 chromosomal DNA와는 분리되어 있다. 플라스미드는 박테리아나 효모 혹은 기생이나 공생 관계로 보다 고등 eukaryotic cell들 안에 존재한다. 이것은 수천 base pair서부터 100 kilo base pair까지의 다양한 크기를 갖는다. 염색체 DNA와 마찬가지로 이 플라스미드 DNA도 분열전마다 복제된다. 세포 분열 동안 적어도 하나 이상의 플라스미드가 딸세포 속으로 들어가게 되며, 이런 성질로 인해 plasmid는 세대를 계속해서 숙주 세포 안에 존재할 수 있게 된다. 많은 자연적으로 존재하는 플라스미드는 공생관계로 숙주 세포에 이익을 제공한다. 예를 들어 어떤 박테리아 플라스미드는 항생제에 대한 저항을 가지고 있어서, 이런 플라스미드를 가지고 있는 박테리아는 항생제가 존재하는 환경 속에서도 생활할 수 있게 된다.

 

이러한 항생제에 대한 저항성은 박테리아 감염원에 대한 치료에 걸림돌로 작용하고 있다. 항생제가 널리 쓰이게 되면서, 몇 종류의 항생제에 내성을 가진 플라스미드가 진화되어 박테리아에게 다양한 항생제에 대한 내성을 심어주게 되었다. 많은 플라스미드들은 또 한 copy의 플라스미드를 다른 박테리아로 옮기는 단백질을 코딩하는 transfer gene을 가지고 있다. 플라스미드의 이동은 복잡한 고분자 tube인 pilus를 통해 이루어 지는데, 이 pilus는 transfer gene으로 만들어진 몇 종의 단백질로 이루어져 있다.

 

 

Transfomation된 개체의 판별

Transformation이라는 현상은 플라스미드 vector를 E.coli cell에 도입하고 발현할 수 있게 한다. 그러나 DNA clonning에서 유용하게 쓰이기 위해서 플라스미드는 특정 항생제에 대한 내성을 포함하고 있어야 한다. 예를 들어 ampicillin-resistance gene은 β-lactamase를 encode하는데, 이 효소는 암피실린을 inactivate한다. 플라스미드가 첨가된 후, 플라스미드를 취한 cell들은 암피실린을 포함한 배지에서 배양함으로써 쉽게 판별을 해낼 수가 있다.

 

보통의 E.coli cell들은 배지에서 직접 플라스미드 DNA를 취할 수 없다. 그렇지만 cell들을 특정한 divalent cation의 높은 농도에 노출시키면, 일부 cell들은 이해되지 않은 메커니즘에 의해 외부 DNA를 받아들일 수 있게 된다. 전형적인 경우에 E.coli cell들은 CaCl₂로 처리되고 플라스미드 vector와 섞인다. 보통 10000개의 cell들 중에 하나의 cell만이 외부 DNA를 받아 들일 수 있는 competent한 상태가 된다. 각각의 competent cell들은 하나의 플라스미드 DNA 분자를 받아들인다. 처리된 cell들이 영양 배지에 plating되어 배양되면, 오직 매우 적은 plasmid를 받아들인 세균만이 생존하게 된다. 살아남은 colony의 모든 세균들은 하나의 E.coli cell 로부터 유래한 것이 된다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) competent cell과 DNA를 ice에서 보관한다.

 

2) DNA 적정량과 competent cell을 섞고, ice에서 15 분간 보관한다.

 

3) Sample을 42℃에서 90 초간 보관하고 ice에 잠시 보관한 뒤, LB 200㎕를 넣어 준다.

 

4) 1 시간 동안 37℃에서 배양한다.

 

5) LB-Amp 고체배지에 spreading 하고, 하루동안 배양한 뒤 colony를 counting 한다.

 

 

 

[일반생물학실험]Transformation - 원핵생물 실험

 

 

E.coli의 Transformation 레포트