생화학실험 | RNA polymerase 분리 정제

 

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) Cell lysis

① pellet을 녹인 후 Buffer LB 26㎖ 분주하여 섞는다.

② 잘 섞은 pellet을 ice에 박혀있는 비커에 붓고 stirring하여 6㎖ lysozyme에 분주한 다음, 66㎖ PMSF와 33㎕ leupeptin도 첨가한다. (20min 반응시간 준다.)

③ 20min 후, 3㎖ 0.8% Sodium deoxycloate 첨가하고 20min 반응 시간 준다.

④ 20min 후, 50㎕ PMSF 첨가하고 5.6㎖ 2M Ammonium Sulfate 첨가한다.

⑤ Total volume 56㎖ 까지 Buffer LB를 첨가한다.

⑥ 5.6㎖ 10% PEI를 아주 천천히 넣어주고 20 min 반응시간 준다.

⑦ 39.00g 4도에서 15min ㎕tra centrifuge한다.

⑧ supernatant만 비커에 담고 전체 volume의 0.82배(46㎖) ammonium Sulfate를 천천히 첨가시켜 15min 반응시킨다.

⑨ 12.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다.

⑩ supernatant는 버리고 17㎖ lysis buffer (1XBuffer C + 100mM NaCl) 첨가하여 용해시 킨다.

⑪ 투석 시 사용하는 membrane을 미리 D.W에 담근다. (3.3㎖/1㎝)

⑫ protein solution을 membrane에 넣고 clip으로 잡은 후 4도, chamber에서 O/N

 

2) Cell Purification

① 단백질을 4℃, 12000g에서 20분 Centrifuge한다.

② Supernatant만 비커에 담고 50㎕ PMSF 첨가한다.

③ Colom에 위의 solution을 흘려보낸다. 흘려나오는 Buffer을 비커에 담는다. (50㎖; loading eluent)

④ Washing Buffer 120㎖을 흘려보낸다. (200㎖ ; Washing eluent)

⑤ Elution Buffer 200㎖을 흘려보낸다. (200㎖ ; Eluted protein)

 

 

 

[생화학실험] RNA polymerase 분리 정제 레포트