화공기초실험 | 염색체 DNA의 정제 및 분석

Agarose gel의 전기영동법

단백질이나 핵산 등의 고분자물질은 전하를 띄므로 이를 기초로 하여 이들 분자를 전기장에서 이동 분리시켜 이들의 순도나 성질의 분석 및 분리 등에 사용하는 방법을 전기영동법이라고 한다. 전기영동에서 하전 분자의 이동 방향은 그 분자가 갖는 전하의 부호에 의하여 결정되지만, 전기영동에서 고분자를 움직이는 힘은 전장의 세기(E)이다.

 

전기영동에 필요한 세가지 성분은 1)전하를 띤 입자, 2)전장, 3)이동이 일어날 수 있는 medium이다. 본 실험에서 DNA분자를 사용했는데 이는 DNA 골격 축에 존재하는 인산 때문에 전기적으로 음전하를 뛰어서 전기장에 놓일 때 양전극을 향해 이동하게 된다. 이때 이동하는 속도는 1)분자의 net electric charge, 2)분자의 크기와 모양, 3)작동온도, 4)supporting medium의 성질, 5)전장의 세기(electric field strength) 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다.

 

단백질의 전기영동은 일반적으로 아크릴아미드(acrylamide)를 N,N-메틸렌 비스아크릴아미드로 결합시킨 중합체인 폴리아크릴아미드 젤(poly-acrylamide gel)을 가장 많이 사용한다. 그러나 분자량이 큰 고분자(200kDa 이상)를 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 할 경우 폴리아크릴 아미드의 농도가 매우 낮아야 하므로 젤이 너무 약하여 다루기가 어렵다. 그러므로 이때는 agarose를 사용하거나 폴리아크릴아미드와 agarose를 섞어서 만든 젤로 전기영동을 하면 된다. 일반적으로 분자량이 큰 핵산의 분석은 주로 0.8% agarose gel로 전기영동을 한다. 본 실험에서도 분자량이 큰 고분자였기 때문에 agarose gel을 이용해 실험을 했다.

 

우선 DNA를 장치 구멍 안에 넣고, 전류를 겔 안에 흐르도록 한다. 이 때, DNA는 산성이기 때문에 중성 pH상태에서 음전하를 가지고 전기영동을 시키면 양각을 향해 이동한다. 그러므로 DNA는 음전하를 띄므로 전류가 걸리는 방향을 주의해서 놓아야한다. 대조군인 DNA ladder 와 두 종류의 DNA가 같이 이동하기 시작하는데 DNA 밴드 길이가 긴 DNA는 gel을 통과할 때 마찰력으로 인한 저항을 많이 받게 되므로 이동 속도가 비교적 느리다.

 

따라서 밴드 길이가 긴 DNA가 짧은 DNA보다 이동거리가 짧다. 전기영동을 하기 전에 넣었던 EtBr(Ethidium Bromide)은 DNA 염기쌍들 사이로 끼어들어가는 평면형태의 분자들인데, 사이로 끼어 들어가면 DNA의 이중나선구조가 일부 풀어지게 된다. 일부 염기쌍 사이로 끼어들어간 EtBr에 자외선 영역의 빛을 쏘이면 형광색을 띠는데 이를 통해 대조군과 비교하여 DNA의 대략적인 bp를 알 수 있다.

 

agarose gel electrophoresis는 PCR실험이 수행되었는지를 결정하기 위해서 뿐만 아니라 추가적인 정보를 얻기 위해 사용되기도 한다. 예를 들어 주형 DNA의 증폭된 부위에 존재하는 restriction site는 agarose gel에서 시료를 전기영동하기 전에 PCR산물을 제한효소로 처리함으로써 결정될 수 있다. 또한 PCR산물의 정확한 크기는 주형 DNA가 증폭된 부위에 insertion이나 deletion mutation을 가지고 있는지를 결정하기 위해 이용될 수 있다.

 

 

실험 방법

1. PCR

1) micro tube에 정량한 모든 시약을 넣고 뚜껑을 닫는다.

2) 시약이 잘 섞이도록 볼텍싱으로 잠시 Down시킨다.

3) PCR에 tuve를 위치시킨뒤 뚜껑을 닫는다.

4) 기계의 온도와 싸이클(30회)을 설정한다.

① 1단계- denaturation : 5분, 95℃

② 2단계- annealing : 1분, 55℃

③ 3단계- polymerization : 5분, 72℃

 

2. Agarose gel 전기영동 확인법

1) 삼각플라스크에 10배로 희석된 TAE buffer 30㎖에 agar 0.3g를 넣는다.

2) 시료를 간단히 흔들어 섞어준 후 랩으로 입구를 살짝 막고 전자랜지에 1분간 가열한다.

3) 꺼낸 플라스크를 미지근할 때까지 식힌 후 EtBr 2㎕를 가한다.(EtBr은 발암물질이므로 피부에 닿지않도록 주의한다.)

4) 시료를 holder에 붓고 15분간 식히며 굳게 한다.

5) 젤 형태로 굳은 것이 확인되면 holder를 전기영동기에 꽂는다.

6) 젤의 첫 홈에 ladder 혼합용액 6㎕를 주입한다.

7) 젤의 나머지 홈에 PCR을 마친 DNA 4㎕와 loading dye 2㎕를 섞어서 주입한다.

8) 10분은 50V로 전기를 흘려보내주다가 마지막 15분은 100V로 흘려보낸다.

9) 전기영동기를 끄고, holder를 꺼내어 UV광학기에 젤만 빼서 올려 보호커버를 덮고 UV를 켠 후, 형광띠를 확인한다.

 

 

 

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