생화학실험 | 형질전환 - 대장균 DNA 전기영동 관찰

 

 

형질전환

형질전환(transformation)은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적 성질을 변하게 하는 일을 말한다. 이는 1928년 영국의 그리피스가 Diplococcus pneumonia를 이용하여 실험한 것이 계기가 되어 발견된 실험 방법이다. 세포는 외부의 DNA를 받아들임으로써 원래 갖고 있는 성질과는 다른 새로운 유전형질을 발현할 수 있게 된다. Transformation 에서는 외부의 DNA를 벡터를 이용해 bacteria cell에 주입해 준다.

 

이러한 벡터를 이용한 외부 DNA를 세포에 주입하는 방법으로는 또한 Transfection이 있다. Transfection은 Transformation과 같이 외부 DNA를 세포에 주입한다는 것은 같지만 가장 큰 차이점으로 Transfection은 bacteria cell이 아닌 동물세포에 DNA를 주입한다는 것에 있어 다르다. 이러한 Transformation이나 Transfection에서 DNA를 host cell에 주입할 때는 주로 vector를 통해 주입해 준다.

 

여기서 Vector란 원하는 DNA를 host cell에 도입하여 증식시킬 때에 이용되는 DNA의 절편으로 다음과 같은 필요조건을 갖는다. ① 숙주세포에 효율적으로 도입 가능하고, 도입 후 복제가 가능할 것, ② DNA 단편의 절단과 연결을 위해 몇 가지 적당한 제한효소 절단부위를 가질 것, ③ DNA단편이 숙주세포에 도입된 것을 나타낼 수 있도록 약제내성 등의 표지유전자를 갖고 있어야 한다는 것 등이 그 조건이다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 아이스버킷에 아이스를 넣을 준비, -70℃에 보관중인 Competent cell을 아이스에 꽂아서 녹였다.

 

2) 100㎛ Competent cell에 DNA를 50pg 넣고 30분 동안 기다렸다. 10ng/㎖ 인데 50pg넣으려면 5㎖(1㎎=1000ng=1000000pg / 1ng=1000pg)

 

3) 42℃ 항온수조에 45초 동안 담궈 두었다.(큐브를 흔들지 않는다)

 

4) 2분 동안 아이스에 꽂아뒀다.

 

5) SOC 1㎖을 첨가 225RPM 37℃에서 1시간 동안 배양했다.

 

6) 배양된 SOC를 가지고 적당한량을 희석해서 LB plate(0.01% ampicillin)에 도말했다.

 

7) sample 배지도 만들었다.

 

8) P1 250㎖ → 1분 원심분리 → 액체배지제거 → 1분 원심분리 → 액체배지제거 → 대장균만 남김

 

9) P2 250㎖ → 4번 정도 뒤집어줌 → lysis×2

 

10) N3 350㎖ → 4번 정도 뒤집어줌(중화) → 10분 동안 원심분리기에 돌림 → 가라앉은 것은 버리고 떠 있는 액체만 옮김 → 1분 동안 원심분리기에 돌림 → 액체배지제거

 

11) PB 500㎖ → 1분 원심분리 → Bind

 

12) PE 750㎖ → 1분 원심분리 → 아무것도 넣지 않고 1분 원심분리 → wash

 

13) EB 50㎖ → 1분 가만히 나둠 → 1분 원심분리 → 1분 가만히 나둠

 

14) 전기영동(Agarose) → DNA 정량

 

 

 

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