생화학실험 | Purification of Plasmid DNA

 

 

 

TIP

 

 

Bacteria의 plasmid에 대해 알아보고 DNA의 구조에 의한 추출 원리를 이해한다.

 

 

 

Plasmid

세균세포내에서 염색체와 독립적으로 존재하며 증식할 수 있는 환형DNA. 모든 플라스미드는 복제 개시점이 될수 있는 적어도 한 개의 DNA염기서열을 가지며 큰 플라스미드는 자체에 복제 효소를 가지기도 한다. 세균의 생존에 필수적인 유전정보를 가지고 있는 것은 아니지만 플라스미드에서 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자,세균의 자웅을 결정하는 성결정인자등이 발견되고 있다. 제한효소로 고리를 끊은 뒤, 진핵생물의 DNA를 삽입하여 잡종 플라스미드를 만들어도 세균안에서 정상적으로 작동하고 증식하며, 이를 이용한 유전자 재조합을 통해 유용한 단백질을 얻을 수 있다.

 

 

Vector

필요한 유전자를 잘라내어 플라스미드에 삽입한 후 재조합된 플라스미드를 세균안에 집어 넣는다. 숙주 내 플라스미드의 증식에 따라서 필요한 유전자가 복제되고 유용한 물질들이 합성된다. 이때 플라스미드는 유전자를 운반하는 역할을 하기 때문에 벡터 (vector 운반체)라고 불려진다. 세균은 숙주라고 부른다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 전날 배양한 cell을 e-tube에 담아 13000rpm, 1min 원심분리. 배양한 bacteria cell을 침전시킨다.

 

2) supernatant를 버리고, sol. I을 150㎕ 넣고 vortexing. cell의 침전을 확인 한 후 상층액을 버리고 EDTA로 세포벽을 파괴하여 DNA를 꺼내기 쉬운 상태로 만든다. 이때 glucose로 삼투압을, Tris-Cl로 pH를 유지하여 세포벽이 파괴된 이후에도 세포가 형태를 유지할 수 있도록 한다. 세포에 용혈 현상이 생기면 gDNA가 잘개 깨져 plasmid와 구별하기 힘들게 되기 때문이다.

 

3) sol II를 300㎕ 넣고 5회정도 inverting(vortexing X) : DNA가 나올 수 있도록 SDS를 통해 세포막을 분해 한다. SDS는 일종의 계면활성제로 세포막의 지질과 결합하여 세포내 물질들이 밖으로 나올 수 있게 한다. 이때 SDS와 함게넣은 NaOH가 pH를 올려 세포안에서 나온 DNA와 단백질들이 변성되도록 한다. 이것은 plasmid와 DNA의 구조적 차이를 이용하여 sol III과정에서 plasmid만을 분리하기 위함이다. 실험과정중에 Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게 처리한다. (vortexing하면 안된다)

 

4) sol III를 200㎕ 넣고 5회정도 inverting(vortexing X) : glacial acetic acid를 넣어주어 용액을 중화 시킨다. pH가 7.0까지 낮아짐에 따라 DNA가 다시 원래모습으로 돌아가게 되는데 이때 supercoil의 형태인 plasmid는 원형으로 비교적 잘 돌아가지만 linear형태인 gDNA와 단백질들은 원형으로 돌아가지 못하고 엉킨다. 이때 함께 넣어주는 potassium acetate는 K⁺가 DNA의 - charge를 상쇄시켜주는 역할을 하여 DNA가 SDS, potassium과 함께 잘 침전되도록 한다.

 

plasmid의 supercoil 구조

 

5) 13000rpm, 10min, 4℃ 원심분리. 엉킨 gDNA와 단백질들을 원심분리를 통해 침전시킨다.

 

6) 새 e-tube에 supernatant를 옮기고 1volume의 chloroform을 넣고 5분간 inverting. plasmid는 상층액에 남아있으므로 상층액만을 다른 튜브로 옮긴 후, 유기용매인 chloroform을 넣어 상층액에 남아있을 단백질들을 변성시켜 제거한다. 변성된 단백질들은 수용액 속에 녹지 않으므로 침전된다.

 

7) 13000rpm, 10min, 4℃ 원심분리. 변성시킨 단백질을 침전시켜 분리해낸다.

 

8) 6～7과정 반복

 

9) 새 e-tube에 supernatant를 옮기고 1volume의 isopropanol을 넣고 RT(상온), 20min. plasmid를 pellet으로 추출하기 위하여 plasmid가 포함되어있는 상층액에 isopropanol을 넣어 plasmid를 침전시킨다.

 

10) 70% EtOH에 10분간 washing. 70% EtOH를 이용하여 시약들과 불순물을 제거한다.

 

11) RT에서 pellet을 수분간 말린 후 aspirator을 이용하여 alcohol을 완전히 제거

 

12) D.W 50㎕을 넣어 pellet을 녹인다.

 

13) 1% agarose gel에 전기영동하여 확인한다.

 

 

 

[생화학실험]Purification of Plasmid DNA 레포트