화학공학실험 | Electrophoresis - 전기영동

 

 

 

TIP

 

 

단백질의 기본적인 개념과 단백질의 분리정제에 대해서 이해하고, 단백질의 분리의 가장 일반적인 방법인 1-D 전기영동 실험을 이용하여 목적하는 단백질의 분리 및 단백질체학(proteomics)의 기본적인 지식을 배양하도록 한다. 

 

 

 

실험 방법

1. Casting & Running (Denaturing SDS-PAGE)

① 전기영동 키트의 고유한 방법에 따라 유리판을 casting한다.

 

② Stacking gel과 running gel 용액을 준비한다.

Ⓐ Stacking gel과 running gel 모두 부족할 때를 대비 하여 충분히 만든다

Ⓑ Running gel은 15%, Stacking gel은 5%가 되게 만든다.

 

③ Running gel 용액에 ammonium persulfate와 TEMED를 첨가한 후 거품이 나지 않을 정도로 신속히 섞고 pipette을 사용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 붓는다.

Ⓐ TEMED는 반응 촉매이므로 Running gel 을 준비하는 과정에서 유리판 사이의 공간의 붓기 직전에 섞어준다.

Ⓑ 10% APS 또한 같이 섞어준다. APS와 TEMED는 겔을 굳히는 역할을 한다.

 

④ Stacking gel의 높이(약 2～3㎝)를 고려하여 running gel용액을 부어준 후 그 위에 증류수를 조심스럽게 가해준다 (이는 running gel의 윗표면을 고르게 해주는 효과 외에 공기를 차단하여 gel이 고르게 중합되게 하기 위한 것이다). Gel이 굳을 때까지 방치한다.

 

⑤ Gel이 굳으면 상층에 가한 증류수와 acrylamide사이에 뚜렷한 경계가 보이는데 이때 증류수를 제거한다.

 

⑥ 미리 준비해 놓은 stacking gel 용액에 ammonium persulfate와 TEMED를 첨가한 후 신속히 섞고 pipette을 사용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 붓고 comb을 끼운다.

Ⓐ TEMED는 반응 촉매이므로 Running gel 을 준비하는 과정에서 유리판 사이의 공간의 붓기 직전에 섞어준다.

Ⓑ 10% APS 또한 같이 섞어준다.

 

 

⑦ Gel이 다 굳으면 조심스럽게 comb을 빼낸 후 형성된 well을 증류수로 여러 차례 세척한다.

 

⑧ Casting한 gel을 전기영동장치에 장착하고 전기영동용 완충용액을 위와 아래의 완충용액탱크에 붇는다.

 

⑨ Well에 조심스럽게 시료를 가한다.

Ⓐ Azurin과 sample loading buffer를 혼합하여 가열을 통해 단백질을 풀어준다.

Ⓑ 마찬가지로 Cytochrome C와 sample loading buffer를 혼합하여 가열을 통해 단백질을 풀어준다

Ⓒ 사용하지 않는 well에도 5㎕의 sample loading buffer를 가해준다.

Ⓓ 10개의 well중에 한 곳에는 Azurin 시료를 넣어주고 또 한곳에는 같은 용량의 Cytochrome C 시료를 가한다.

Ⓔ 시료를 모두 가한 후 다시 한 번 내부에 찰랑찰랑 하도록 완충 용액을 붓는다.

 

 

⑩ 전기영동 기구를 전원에 연결시킨 후 정전압 또는 정전류에서 전기영동을 한다. Mini-gel의 경우에 100V 정전압에서 1시간 30분이 소요된다.

Ⓐ 100V 정전압에서 30분 동안 전기영동을 한다.

Ⓑ 그 후 120V에서 1시간가량 전기영동을 한다.

 

⑪ 이동지표인 bromophenol blue(sample loading buffer)가 gel의 끝부분에 도달하면 전원을 내리고 전기영동 장치로부터 유리판을 분리한다.

 

⑫ 전면의 작은 유리판을 겔이 찢어지지 않도록 조심스럽게 분리하고, 후면의 큰 유리판으로부터 마찬가지로 겔이 찢어지지 않도록 조심스럽게 분리하여 용기(반찬통등)로 옮긴다.

 

2. Gel Staining/Destaining (Coomassie Brilliant R250)

① 통에 옮겨진 겔에 staining solution을 붓는다 (gel volume의 5배 정도가 적당, 10×8 ㎝ mini-gel인 경우에 25㎖ 정도)

 

② Shaker에 올려놓은 후 30분-1시간 염색한다 (전반적으로 gel이 파랗게 보이고 단백질 밴드가 좀더 진하게 보이는 상태가 가장 좋다).

 

③ destaining solution을 부어준 후 다시 shaker에 올려 놓은다.

 

④ Destaining solution을 수차례 교환하면서 gel의 염색시약이 모두 빠지도록 한다.

 

 

 

[화학공학실험]Electrophoresis - 전기영동 레포트