일반생물학실험 | DNA work

 

 

 

TIP

 

 

세균의 세포벽을 파괴하고 plasmid DNA를 분리한다. 분리한 plasmid DNA를 형질전환을 시키고 배지에서 키운다. 배지에서 키운후 제한효소를 이용해 잘라낸뒤 전기영동을 시켜서 관찰한다.

 

 

 

미생물학 실험을 수행하는 데 있어서 가장 기본이 되는 재료가 DNA이므로 많은 양의 DNA를 확보하는 것이 무엇보다 중요하다. 이를 수행하기 위해 외부 DNA를 숙주 세포 내로 도입시키는 방법인 형질전환(Transformation)을 이용하는데 이 방법은 박테리아 세포에 물리적 내지는 화학적 자극을 주어 Plasmid DNA를 받아들일 수 있는 상태로 만들어, DNA가 세포 내로 들어가게 한 다음, 이들 형질전환 된 세포들을 배양함으로써 이루어진다.

 

이처럼 DNA를 다량으로 얻는 것 이외에도 Library DNA나 실험실에서 조작된 Recombinant DNA plasmid를 형질전환하여 여러 가지 실험에 이용할 수 있다. Recombinant DNA plasmid가 들어가 있는 E.coli로부터 직접 plasmid를 뽑아보고, 특정 염기서열을 인식하여 잘라내는 제한효소를 사용해 직접 DNA를 잘라보고, 이를 전기영동을 통해 크기를 확인함으로써 분자생물학적 실험의 기본이 되는 DNA관련 실험에 대해 이해할 수 있다.

728x90

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) colony 1개를 Antibiotics(예-Ampicillin)가 포함된 liquid LB 5㎖에 접종하고 37℃ shaking incubator에서 12～16시간(O/N) 키웠다.

 

2) Bacteria가 자란 LB중 1㎖을 E-tube로 옮겼다.

 

3) 12,000rpm 30초(또는 3,000rpm 15분)간 원심분리하고 상층액을 완전히 버렸다.

 

4) Resuspension buffer를 250㎕넣고 vortexing을 하여 pellet을 완전히 풀어주었다.

 

5) Lysis buffer를 250㎕넣고 5～6회 inverting해주었다.

 

6) Neutralization buffer를 350㎕넣고 9～10회 inverting해주었다.

 

7) 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다.

 

8) 상층액을 column에 옮겼다.

 

9) 12,000rpm에서 1분간 원심분리하고 collection tube에 있는 용액을 버렸다.

 

10) Washing buffer A 700㎕를 넣고 1분 원심분리하고 collection tube의 용액을 버렸다.

 

11) Washing buffer B 700㎕를 넣고 1분 원심분리하고 collection tube의 용액을 버렸다.

 

12) 빈 collection tube에 column을 끼우고 12,000rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.

 

13) column을 E-tube에 옮기고 50㎕의 elution buffer를 넣은 후 1분간 incubation하였다.

 

14) 12,000rpm에서 1분간 원심분리 하였다.

 

15) competent cell을 20㎕에 지난주에 뽑았던 DNA를 1ng 넣었다.

 

16) 1초간 voltexing 하였다.

 

17) 42℃에 45초 정도 heat shock을 주었다.

 

18) 1초간 voltexing 하였다.

 

19) LB 배지에 Amp를 추가한배지와 추가하지 않은 배지를 구분하였다.

 

20) LB plate에 tube Amp+와 Amp-를 각각 뿌려주었다.

 

21) 두 plate를 유리 spreader로 도말한 후 37℃에서 12～16시간 incubation시켰다.

 

22) 준비해둔 DNA를 제한효소로 반응을 시켰다. (Single cut, Sal 1) (D.W = 13㎕ , 10x bf = 2㎕ , 10x BSA = 2㎕ , DNA = 2㎕ , Sal 1 = 1㎕)

 

23) 반응시킬 동안 1.0% Gel 을 만들었다.

 

24) 작은 판 4개 기준으로 1x TAE 100㎖에 agarose 1.0g을 넣었다.

 

25) 전자렌지에 2분 정도 돌린 후 식힌 다음 EtBr을 조금 (1㎕)넣은 후 판에 붓고 comb을 꼽은 후 20분 식혔다.

 

26) Electrophoresis Kit를 준비하였다.

 

27) 1x TAE를 표시선까지 붓고 반응시킨 Sample을 6x Dye 2㎕과 섞고 Marker와 함께 Loading하였다.

 

28) Kit를 20-30분간 켜서 Sample을 running하였다.

 

 

 

[일반생물학실험]DNA work 레포트