일반생물학실험 | 단백질의 검출

 

 

 

TIP

 

 

생명현상과 생물체를 이루는 중요한 구성요소 중 단백질을 발색반응을 이용하여 화학적으로 검출하여 보는 실험이다.

 

 

 

확인 반응

1. 뷰렛반응

뷰렛 반응은 5%의 수산화 나트륨용액(또는 수산화 칼륨)과 1%의 황산구리 수용액을 섞어서 만든 뷰렛 용액(푸른색)을 이용하여 단백질을 검출하는 반응이다. 구리이온이 펩티드와 결합할때 색이 변합니다. (감도는 1-10mg 정도) 즉, 뷰렛 용액에 단백질을 넣으면 단백질의 작용기인 펩티드사슬이 구리와 나트륨과 결합하여 형성되는 비스뷰타렛구리(II)산 나트륨(수산화 칼륨의 경우 비스뷰타렛구리(II)산 칼륨)을 생성하면서 색이 보라색으로 변한다.

 

2. 로우리법(Lowry)

1951년에 이반응을 발견한 사람 이름을 사용하였다. 금속성 이온이 고리형구조의 잔기를 가진 아미노산과 결합합니다. (감도는 20-300㎍)

 

3. BCA 법

로우리법을 응용한 방법입니다. BCA란 물질이 들어가죠.

 

4. 브래드포드법(bradford assay)

염색약(쿠마시블루)이 염기성 아미노산(라이신)에 결합하여 색이 변합니다.(감도는 1-100㎍)

 

5. 자외선법

고리형구조의 아미노산이 280㎚의 파장을 가지는 빛을 흡수하는 원리를 이용. 280㎚에서 흡광도를 측정하면 단백질이 얼마나 들어있는지 알 수 있습니다.

 

6. 밀론 반응

밀롱시약을 시료에 첨가하면, 단백질이 있는 경우는 백색침전이생기고, 이것을 60～70℃로 가열하면 벽돌색으로 변한다. 이러한 반응은 단백질을 구성하고 있는 아미노산인 티록신, 디옥시페닐알리닌 등의 페놀고리가 수은 화합물을 만들고, 아질산에 의해 착색된 수은 착염으로 되기 때문이다.

 

7. 크산토프로테인반응 (Xanthoprotein reaction)

단백질을 검출하는 반응으로, 단백질을 함유하는 물질 소량에 진한 질산 1㎖ 가량을 첨가하고 수 분간 끓이면 황색이 되며, 냉각 후 암모니아를 사용해 알칼리성으로 만들면 등황색으로 변화, 반응 한다 (실제로 직접 실험을 하는 과정에서는 암모니아를 사용하지 않고 진한질산만을 사용하였다). 이 반응은 벤젠 고리를 가진 티로신, 트립토판, 페닐알라닌 등의 아미노산이나 이것들을 함유하는 단백질에서 일어난다. 발색은 페닐알라닌, 티로신 등의 아미노산 벤젠고리가 질산에 의해 니트로화합물이 되기 때문에 일어난다.

 

8. 뷰렛반응 (Biuret reaction)

펩티드를 검출하는 반응으로, 뷰렛구조(펩티드결합이 두 개 이상 존재하는 구조)가 2가의 구리 이온과 반응하여 보라색의 착화합물을 형성하여 용액의 색깔이 보라색으로 변하는 특성을 이용한다. (단백질은 기본적으로 펩티드 단위로 이루어져 있기 때문에 뷰렛반응은 펩티드뿐 아니라 단백질을 검출할 수 있는 반응으로 알려져 있다.) 단 몇 개의(3개 이상) 펩티드 결합을 가지고 있는 펩티드도 뷰렛반응을 통해 검출할 수 있다.

 

9. 닌히드린반응 (Ninhydrin reaction)

α-amino산, 펩티드 및 단백질은 pH 4～8에서 Ninhydrin과 함께 100℃로 가열할 때 착색물이 생성된다. Ninhydrin은 아미노산과 반응하여 청자색을 나타내어 아미노산의 발색시약으로 사용된다. 즉, 아미노산을 검출하는 반응으로, 아미노산에 닌하이드린을 가하여 가열하면 청자색으로 발색한다. 닌하이드린을 아미노산의 중성용액에 가하면 아미노기의 작용에 의해서 닌하이드린 2분자가 축합하여 아미노산의 종류에 따른 특유한 색을 나타낸다.

 

반응이 예민하여 50～100만분의 1 정도의 감도를 나타낸다. 아미노산을 종이크로마토그래피 등으로 전개하고, 0.3% 닌하이드린의 뷰탄올 용액을 분무하여 전(全)아미노산을 검출·확인하는 방법이 흔히 쓰인다. 또, 비색정량에도 이용된다. 닌히드린반응은 α-아미노기를 가진 화합물이 나타내는 정색반응(β-,Y-는 정색반응이 불가)이며 단백질뿐만 아니라 유리아미노산, 아미노산으로 구성된 펩타이드류 그 외에 아민류 또는 암모니아 등도 이와 같은 반응을 나타낸다.

 

 

실험 방법

1. 크산토프로테인 반응(Xanthoprotein reaction)

1) 각 시료(알부민, 젤라틴, 증류수, 설탕, 우유) 약 2㎖을 시험관에 넣고 여기에 1㎖의 진한 질산을 가한다.

 

2) 백색 침전이 생성되는 것을 확인한다.

 

3) 이 시험관을 5분간 중탕하여 황색 용액이 되는 것을 확인한다.

 

2. 뷰렛반응

1) 시험관에 각 재료를 2㎖씩 넣고 동량의 10% NaOH 용액을 가하여 잘 혼합한다.

 

2) 0.5% CuSO₄ solution을 각 시험관에 10방울 떨어뜨려 잘 썩은 후 관찰한다.

 

3) 자색이나 적색이 나타나는 것을 확인한다.

 

3. 닌히드린 반응

1) 시험관에 각 재료를 2㎖씩 넣고, 0.1% Ninhydrin solution 10방울을 떨어뜨려 혼합한다.

 

2) 시험관들을 5분간 중탕 후 꺼내어 관찰한다.

 

 

 

[일반생물학실험]단백질의 검출 레포트