생화학실험 | Absorption Spectra

 

 

 

TIP

 

 

분광광도계를 이용한 흡수 스펙트럼을 관찰해 본다.

 

 

 

분광광도계

분광광도계는 크게 광원, 단색화 장치, 검출기로 구성되어 있다. 광원에는 텅스텐 램프(320-2500㎚영역의 복사선), 중수소 아크 램프(200-400㎚영역의 자외선), 글로바(4000-200 의 적외선 복사선), 헬륨-네온 레이저(638㎚), 레이저 다이오드(680-1550㎚의 근적외선) 등이 있다. 단색화 장치는 빛을 각성분 파장으로 분산시키고 좁은 띠의 파장을 선택하여 시료 또는 검출기로 보낸다. 검출기는 광자가 검출기에 도달할 때의 전기 신호가 발생하는 원리를 이용하여 전류의 세기와 복사세기가 비례한다는 사실을 이용하여 흡광도를 측정한다.

 

wavelenght range[㎚]	color(absorbed)	color observed
380∼435	violet	yellow
435∼480	blue	orange
480∼560	green	red
560∼595	yellow	violet
595∼650	orange	blue
650∼780	red	green

 

우리 눈에는 흡수된 빛의 보색이 보인다. 모든 물질들은 AO(Atomic Orbital), MO(Molecular Orbital)을 가진다. MO 형성시 외비탈 내부에 HOMO와 LUMO가 생기는데 전자가 빛과 같은 에너지를 받으면 HOMO에서 LUMO로 들뜨게 된다. 이 때 물질마다 흡수하는 빛이 정해져 있는데 사람눈에 보이는 것은 350∼700㎚정도 파장을 갖는 빛이다. HOMO에서 LUMO로 전자가 들뜰 때 gap만큼 특정한 에너지를 흡수하고 나머지 빛은 투과시키거나 반사시킨다. 흡수된 빛을 제외한 나머지가 우리 눈에 보이는 것이다 이것이 빛의 보색이다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 전 실험에서 만들어진 pH2.4, pH2.8, pH3.2, pH3.6, pH4.0, pH4.4, pH4.8, pH5.2 8개의 0.1M citrate buffer 50㎖에서 피펫을 이용하여 4.5㎖를 tube에 각각 옮긴다.(1000㎕×4번 , 500㎕×1번 = 4.5㎖)

 

2) 8개의 tube에 1.5× Bromophenol blue 0.1㎖(100㎕)을 피펫을 이용하여 첨가한다.

 

3) 마지막으로 95% Ethanol 0.4㎖를 8개 tube에 각각 첨가한다.

 

4) 분광광도계를 이용한 흡광도 측정

① 시료용액을 넣기 전 cuvette에 물을 채우고 분광광도계 holder에 넣어 blank를 걸어준다.

② pH4.4에서의 340∼620㎚(20㎚간격, 15개 파장의 흡광도측정)의 흡광도를 측정한다.(분광광도계의 reader누름)

 

 

③ 준비한 8개의 다른 pH를 띄는 용액의 각 흡광도를 알기 위해 cuvette에 3분의2만큼 채운 후 430㎚에서의 흡광도를 측정한다. (하나의 용액을 흡광도를 측정 후 물이 든 cuvette으로 다시 blank를 걸어준 후 다음 용액의 흡광도를 측정한다.)

④ 측정을 마치면 cuvette을 물로 씻어준다.

 

 

 

[생화학실험]Absorption Spectra 레포트