화학공학실험 | DNA 정제 및 분석

 

 

 

TIP

 

 

박테리아로부터 염색체 DNA를 분리․정제 하는 과정에서 각 시약과 Enzyme의 작용과 실험과정을 이해하고 PCR과 전기영동법에 대해 알아보며 장치의 조작 방법을 습득한다.

 

 

 

Central dogma

유전정보(genetic information)는 DNA에 의해 암호화되어 저장되며, DNA 복제(replication)에 의해 다음 세대로 전달된다. 또한 전사(transcription)의 과정을 통해 DNA에 있던 유전정보는 RNA로 옮겨가고 다시 번역(translation)의 과정을 거치면서 만들어진 단백질(protein)에 의해 유전정보가 실체화되어 몸속에서 기능을 하게 된다. 이처럼 유전정보는 DNA에서 RNA, 단백질로 전환되면서 생명활동을 유지시키는데 필수적인 유전정보의 흐름을 형성하는데 이러한 흐름의 기본적인 원리를 분자생물학의 중심원리라고 한다.

 

중심원리의 핵심에는 이미 발현된 단백질의 유전정보가 거꾸로 DNA로 옮겨가지 않는다는 의미가 들어있다. 1953년에 염색체 DNA가 RNA 합성의 주형으로 이용되고 이 RNA가 세포질로 이동되어 단백질의 아미노산 서열을 결정짓는다는 가설이 제안되었고, 이러한 가설이 그 후 많은 연구에 의하여 점차 지지를 받게 되었는데, 그 결과 1958년에 프란시스 크릭(Francis Crick)이 이와 같은 유전정보의 흐름의 원리를 중심원리(central dogma)라고 지칭하였다. 이후 분자 생물학의 발전에 따라 생명체 내의 다양한 유전정보의 흐름들이 알려졌다.

 

 

 

실험 방법

1. 세포에서의 DNA추출

1) OD가 1.0이 조금 넘은 배양 세포(5㎖)를 마이크로 튜브에 넣고, 10분동안 7500rpm으로 원심분리한다. 상등액은 버린다.

 

2) ATL buffer를 180㎕ 넣은 후 희석시킨다.

 

3) 20㎕의 proteinase K를 추가하고, 볼텍싱하여 섞어준다. 55℃에서 3시간 배양하여 완전 히 분해시킨다. 샘플이 분해되는 동안 종종 볼텍싱을 해준다. 또는 shaking용 water bath를 사용한다. (샘플은 젤라틴 같은 것이다. 너무 심하면 처음 시작 배양의 OD가 너무 심했던 것이다.)

 

4) 15초동안 볼텍싱한다. AL buffer 200㎕넣고, 즉각적으로 충분히 볼텍싱 해야한다. 그리 고 10분간 70℃에서 배양한다. (AL buffer 때문에 처음에 침전이 보이지만 배양하면서 녹을 것이다.

 

5) 200㎕에탄올을 추가한다. 그리고 충분히 볼텍싱한다.(하얀침전이 생길것임)

 

6) 2㎖ 콜렉션 튜브로 스핀컬럼을 꽂아둔다. 샘플을 피펫을 사용해 컬럼으로 옮긴다. 8000rpm으로 1분간 원심분리. 2㎖의 콜렉션 튜브를 버린다.

 

7) 새로운 콜렉션 튜브로 스핀컬럼을 옮겨둔다. AW1 buffer 500㎕를 추가하고, 8000rpm 으로 1분동안 원심분리한다. 2㎖의 콜렉션 튜브를 버린다.

 

8) 새로운 콜렉션 튜브로 스핀컬럼을 옮겨둔다. AW2 buffer를 500㎕추가하고, 14000rpm 으로 3분간 원심분리한다. 2㎖의 콜렉션 튜브를 버린다.(또 다른 콜렉션 튜브로 14000rpm으로 1분간 돌려서. 에탄올을 모두 없앤다.)

 

9) 깨끗한 1.5㎖ 마이크로튜브로 스핀컬럼(들어있지 않음)을 옮긴다. 막의 바로위에 AE buffer 20㎕를 주입한다. 1분간 상온에 둔 후, 8000rpm으로 1분간 원심분리한다.

 

2. PCR

1) micro tube에 정량한 모든 시약을 넣고 뚜껑을 닫는다.

 

2) 시약이 잘 섞이도록 볼텍싱으로 잠시 Down시킨다.

 

3) PCR에 tuve를 위치시킨뒤 뚜껑을 닫는다.

 

4) 기계의 온도와 싸이클(30회)을 설정한다.

 

3. agarose gel 전기영동 확인법

1) 삼각플라스크에 10배로 희석된 TAE buffer 30㎖에 agar 0.3g를 넣는다.

 

2) 시료를 간단히 흔들어 섞어준 후 랩으로 입구를 살짝 막고 전자랜지에 1분간 가열한다.

 

3) 꺼낸 플라스크를 미지근할 때까지 식힌 후 EtBr 2μℓ를 가한다. (EtBr은 발암물질이므로 피부에 닿지않도록 주의한다.)

 

4) 시료를 holder에 붓고 15분간 식히며 굳게 한다.

 

5) 젤 형태로 굳은 것이 확인되면 holder를 전기영동기에 꽂는다.

 

6) 젤의 첫 홈에 ladder 혼합용액 6μℓ를 주입한다.

 

7) 젤의 나머지 홈에 PCR을 마친 DNA 4μℓ와 loading dye 2μℓ를 섞어서 주입한다.

 

8) 10분은 50V로 전기를 흘려보내주다가 마지막 15분은 100V로 흘려보낸다.

 

9) 전기영동기를 끄고, holder를 꺼내어 UV광학기에 젤만 빼서 올려 보호커버를 덮고 UV를 켠 후, 형광띠를 확인한다.

 

 

 

[화학공학실험] DNA 정제 및 분석 레포트