생화학실험 | 단백질 정량 분석 - BCA법 & SDS-PAGE 분석 & Western Blot

 

 

 

TIP

 

 

BCA Method를 이용하여 우유 중의 단백질 함량을 분석하고 SDS-PAGE와 Coomassie Blue 염색을 통해 단백질의 전기영동 결과를 관찰한 것을 바탕으로 Western Blot을 시행하여 membrane에 transfer시켜, 항원-항체 반응을 이용하여 특정한 단백질의 정량 분석과 검출하는 방법을 실험을 통해 숙지한다.

 

 

 

실험 방법

1. 단백질 정량분석-BCA법

1) Sample & stardard 제조

➀ 우유 속에는 약 5%의 단백질이 들어 있고, 1㎖속의 우유에는 약 50㎎이 들어 있는데, BCA법의 정략정 단백질 양 범위는 20～2000μg/㎖이므로 이를 1/100으로 희석하여 Epp. tube에 담았다.

 

➁ Albumin Standard Ampules의 농도는 2.0㎎/㎖이기 때문에 6개의 Epp. tube에 주기를 한 후 계단 희석법을 통해 2000, 1000, 500, 250, 125, 0μg/㎖의 standard를 만들었다.

 

➂ Reagent A 10㎖와 Reagent B 0.2㎖ (50:1)을 혼합하여 Working sol’n을 만들었다.

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2) Test tube method

① Test tube에 0.1㎖의 standard와 sample들과 2㎖의 Working sol’n(1:50)을 넣은 후 30초 동안 mix

 

② Water bath에서 60℃로 30분 동안 반응

 

③ 상온에서 냉각

 

④ Spectrophotometer에서 562㎚의 파장으로 측정

 

3) Microplate method

① Microplate에 25㎕의 standard와 sample들과 200㎕의 Working sol’n(1:8)을 넣은 후 30초 동안 mix

 

② Water bath에서 37℃로 30분 동안 반응

 

③ 상온에서 냉각

 

④ Microplate reader에서 562㎚의 파장으로 측정

 

2. SDS-PAGE 분석

1) Casting & Running

① 10% separating gel & 5% stacking gel을 다음과 같이 준비한다.

 

10% Separating gel 20㎖	H2O	7.93㎖
	30% Acrylamide Sol’n	5.0㎖
	1.5M Tris (pH 8.8)	6.67㎖
	10% SDS	0.2㎖
	10% APS	200㎖
	TEMED	0.008㎖
5% Stacking gel 10㎖	H2O	6.885㎖
	30% Acrylamide Sol’n	1.25㎖
	1.5M Tris (pH 8.8)	1.67㎖
	10% SDS	0.1㎖
	10% APS	0.100㎖
	TEMED	0.010㎖

 

② separating gel을 유리판사이에 주입하여 약 2/3 지점까지 채운다.

 

③ 그 후 500㎕ Ethanol을 유리판 사이에 흘려 넣어 gel의 표면과 공기의 접촉을 차단한다.

 

④ Gel이 완전히 굳은 후 상층의 물을 제거한다.

 

⑤ 유리 plate의 나머지 부분은 5% stacking gel로 채우고 comb를 삽입하여 well을 만든다.

 

⑥ Gel이 완전히 굳었는지 확인한 후 전기영동을 진행한다.

 

⑦ 제조된 SDS-PAGE를 전기영동 Chamber에 설치하고 양극과 음극에 Tris-glycine buffer를 채워준다.

 

⑧ E.coli시료에 동량의 SDS gel loading buffer를 넣고 100℃에서 5분간 끓여 변성시킨다.

 

⑨ 전체 4개의 단백질 시료중 2개에만 IPTG를 첨가한다.

 

⑩ Protein size marker와 가열되어 변성이 완료된 단백질 시료 10㎕를 gel의 well에 loading 한다.

 

⑪ 150V의 전압으로 Bromophenol blue 시약이 gel의 맨 아래 도달할 때까지 전기영동 했다.

 

⑫ 전기영동 후 유리판을 분리하고 gel을 조심스럽게 떼어낸 후 적당한 용기에 옮겼다.

 

⑬ 용기에 옮긴 후 coomassie brilliant blue R-250 staining sol’n에 담궈 50rpm으로 O/N했다.

 

⑭ 염색이 완료된 후 destaining 용액으로 gel을 여러 번 세척하여 단백질 밴드가 나타날 때까지 염색을 제거했다.

 

3. Western Blot

1) SDS-PAGE

① 앞선 실험에서 전기영동까지 한 gel을 사용하여 시행한다. (coomassie blue 염색 전)

 

 

2) Membrane Transfer

① 전기영동 후 유리판을 분리하고 gel을 떼어내고 gel, NC membrane, filter paper, pad를 transfer buffer에 충분히 적셔 준비한다.

 

② 단백질 transfer를 위하여 다음과 같이 gel sandwich를 준비한다.(→ 방향의 gel sandwich)

 

(+)

2 Pad

Filter paper

NC Membrane

Gel 2

Filter paper

Pad

Filter paper

NC Membrane

Gel 1

Filter paper

2 Pad

(-)

 

③ 카세트를 닫고 잠금장치로 잠근 후 카세트를 module에 넣고 transfer buffer로 채워준다.

 

④ Power supplier에 연결하고 25V, 250mA에서 1～2 hr 전기영동을 시행한다.

 

⑤ 전기영동이 끝난 NC membrane은 blocking sol’n(5% skim milk in TBST buffer)을 채운 밀폐용기에 담아 상온에서 보관한다.

 

3) Immunodetection

① 상온에서 50rpm, 1hr동안 blocking sol’n(5% skim milk in TBST)으로 blocking 해준다.

 

② 1차 항체(anti-GST)를 blocking sol’n에 1/10000으로 희석하여 membrane에 더한 후 상온에서 50rpm, 3hr 반응시킨다.

 

③ TBST에 membrane을 5min 동안 담궈 3번 세척한다.

 

④ blocking sol’n에 2차 항체(anti-IgG-AP)를 1㎕ 넣고 RT, 50rpm, 1hr 반응시킨다.

 

⑤ TBST에 membrane을 5min 동안 담궈 3번 세척한다.

 

 

⑥ BCIP/NBT substrate를 아래와 같이 제조한 후 membrane에 첨가하고 발색시킨다.

 

⑦ 발색 완료 후 증류수에 세척한 후 결과를 기록한다.

 

 

 

[생화학실험]단백질 정량 분석 레포트