일반생물학실험 | Bradford assay를 이용한 단백질의 정량

 

 

TIP

 

 

수용액에 녹아있는 단백질의 양을 Bradford 방법으로 정량한다. 이를 위해 표준 용액을 이용한 표준곡선의 작성과 비색정량법을 습득한다.

 

 

 

단백질 분석

켈달 정량분석 방법에서는 시료 중에 함유되어 있는 총 질소함량을 측정하여 단백질 함량을 계산할 수 있도록 되어 있어서 개략적인 분석만 가능케 되어 있는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 많은 학자들은 순 단백질의 총량을 정량할 수 있도록 하는 새로운 방법들을 개발하고 있다. 이들 중 현재까지 많이 이용되고 있는 몇 가지 방법에는 뷰렛방법, Lowry 방법, 탁도 측정법, 펩티드 측정법, 크로마토그래피, 비색법 및 분광광도법 등을 들 수 있다.

 

크로마토그래피는 두 개의 서로 다른 상을 이용하여 화합물을 분리한다. 즉, 정지상과 이동상이 그것이다. 그리고 여러 가지 크로마토그래피들 간의 차이란 상에 사용되는 물질들의 차이를 말한다. 크로마토그래피를 이용하여 단백질, 아미노산, 당류, 지방산, 광물질 및 기타 영량소를 정량하고 독성 물질을 검출할 수도 있다. 비색법이나 분광광도법이란 시료 용액에 광선을 통과시켜서 시료내에 함유되어 있는 영양성분의 농도를 측정하는 화학적 분석 방법이다. 특히, 원자흡수 분광광도계는 광물질 분석에 가장 널리 사용되는 기구이며, 이 기구를 이용하면 광물질의 10억분의 1( g/kg) 농도까지 분석할 수 있게 된다.

 

 

실험 방법

1. 표준곡선 작성

1) BSA 표준곡선을 작성하기 위해 다음의 표와 같이 BSA 표준용액을 제조하여 마이크로튜브에 각각 준비한다

 

BSA(㎕ of 1㎎/㎖ solution)	0(blank)	4.0	8.0	12.0	16.0
H2O(㎕)	200	196	192	188	184
Bradford reagent (㎕)	800
total (㎕)	1000	1000	1000	1000	1000
BSA 농도 (㎍/㎖)	0	4	8	12	16

 

2) Bradford reagent를 800㎕씩 각각 희석한 BSA가 들어있는 마이크로튜브에 넣는다.

 

3) 용액을 잘 섞는다.

 

4) 마이크로튜브를 원심분리기에 넣고 돌린다. (튜브의 뚜껑이나 벽면에 남아있을 수 있는 용액을 튜브 밑으로 완전히 내리기 위해서 진행하는 과정이다.)

 

5) 용액을 cuvette(1㎝로 규격화되어있음)에 옮긴다.

 

6) 595㎚에서 흡광도를 측정한다.

 

2. 시료의 측정

1) 미지의 단백질 샘플 X와 Y, 0.25M Tris-HCl, 0.25M 요소, 0.25M 설탕용액을 각각 200㎕씩 마이크로튜브에 넣는다.

 

2) Bradford reagent를 1)의 마이크로튜브에 800㎕씩 넣고 잘 섞는다.

 

3) 원심분리 후 기포가 생기지 않도록 조심해서 용액을 cuvette에 옮긴다.

 

4) 595㎚에서 흡광도를 측정한다.

 

 

 

[일반생물학실험] bradford assay를 이용한 단백질의 정량 레포트