1. 시험관 내에서 유전자를 조작할 때 쓰이는 도구인 제한효소로 Plasmid DNA를 잘라보고 분석한다. 또한 절단한 Vector DNA와 insert DNA를 ligase로 ligation해보고 대장균에서 그 형질을 발현 시켜 본다.
2. 생명공학의 기초가 되는 분자생물학의 기본실험인 미생물에서의 plasmid DNA를 절단하는 실험이다. 본 실험은 가장 기초가 되는 실험으로서 이 후에 하게될 전기영동 실험에서 응용하게 된다. 전기영동 실험에서는 거대분자들을 연구하기 위하여 사용하는 방법으로 PCR도 사용하게 된다. 이 실험을 통하여 DNA의 분리 및 확인을 알아보려고 한다
제한효소 (restriction enzyme)
제한효소 (restriction enzyme) 혹은 제한 내부핵산 가수분해 효소 (restriction endonuclease)는 이름 그대로 제한 자리(restriction site)라고 알려진 이중 가닥 DNA의 특정 염기서열을 인식하여 그 부분을 절단하는 것을 돕는 효소를 말한다. 이때 제한효소가 인식하는 부위는 palindromic sequence이라는 특이한 서열을 가진다. palindromic sequence는 양 사슬의 5’에서 3’방향으로 똑 같은 염기서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들어 EcoRI는 그림3처럼 DNA 이중 나선에서 GAATTC라는 염기서열을 절단부위로 인식하여 5'-overhang sticky end를 형성한다.
위의 그림3과 같이 DNA의 이중 가닥 중 한 가닥이 돌출된 형태를 sticky end라고 한다.
이와 다르게 DNA 이중 가닥을 수직으로 자르는 제한 효소도 존재한다. 이 제한 효소로 잘린 DNA의 말단부위를 blunt end라고 부른다. 또한 제한 효소마다 인식하는 염기서열의 개수도 차이가 있다. 보통 4～12개의 염기서열을 인식한다. 이렇게 수백 종류의 다양한 미생물로부터 분리된 제한효소는 각기 다른 인식 서열을 가지고 있고, 시험관에서 DNA의 원하는 부위를 자르는데 사용된다.
그러나 세포 자체내의 chromosome에도 제한효소가 인식하는 염기서열이 있을 수 있기 때문에 세포 자체에서 제한효소를 생성할 때에는 자신의 DNA를 절단하는 것을 막기 위해 메틸화 효소를 활성화 시킨다. 이 효소는 자신의 DNA가 복제될 때에 제한효소의 인식 부위에 있는 특정 염기에 메틸기를 첨가하여 제한효소가 그 부위를 절단할 수 없게 만든다.
실험 방법
1. 실험 과정
1) 실험에 사용할 agarose gel을 만들어 굳혀 둔다. Cf) Agarose gel
2) TAX 50㎖에 0.5g agarose powder를 넣고 끓인 후 식힌다.
3) EtBr을 한 방울 넣는다.
4) Gel 틀에 붓고 comb를 꽂은 후 굳힌다.
5) DNA절단
6) Hind Ⅲ 1㎕, KpnⅠ 1㎕, Buffer 3㎕, DNA 1㎕, DW (distilled water) 24㎕을 튜브에 넣고 잘 섞는다.
7) 위의 그림5와 같이 37 ℃ Water bath에서 1시간 동안 배양(incubation)한다.
8) 미리 만들어둔 agarose gel의 comb를 뽑고 전기영동 탱크에 넣는다.
9) 한 조당 agarose gel의 well중 두 곳씩 maker 7㎕ 을 loading한다.
10) 미리 만들어둔 DNA 용액 10㎕과 5x DNA dye 2㎕을 섞은 후 well에 loading한다.
11) 그림과 같은 상태에서 100V의 전압에서 30분 동안 전기영동 한다.
12) DNA가 잘 절단 되었는지 전기영동 한 결과를 확인한다.
13) DNA 삽입
14) 1조는 Vector DNA 1㎕, Insert DNA 3㎕, ligase 1㎕, 10x Buffer 1㎕, DW 4㎕ 이렇게 총 10㎕를 튜브에 넣고 잘 섞는다.
15) 2조와 3조는 Vector DNA 1㎕, Insert DNA 6㎕, ligase 1㎕, 10x Buffer 1㎕, DW 1㎕ 이렇게 총 10㎕를 튜브에 넣고 잘 섞는다.
16) 혼합 용액을 16℃ Water bath에서 1시간 동안 배양(incubation)한다.
17) 혼합 용액 3㎕, corn cell을 섞는다.
18) 5분 동안 ice incubation 한다.
19) 42℃에서 90초간 heat shock를 주어 DNA를 열어준다.
20) 다시 5분간 ice incubation하여 DNA를 닫아준다.
21) LB broth를 50㎕ 넣은 후 37 ℃에서 30분 동안 shaking incubation 한다.
22) 1조와 2조는 200㎕, 3조는 400㎕을 따서 고체 배지에 도말한다.
23) 37℃에서 12～16시간 동안 배양한다.
[일반생물학실험] 제한효소에 의한 DNA의 절단 레포트
1. 실험 목적 가. 시험관 내에서 유전자를 조작할 때 쓰이는 도구인 제한효소로 Plasmid DNA를 잘라보고 분석한다. 또한 절단한 Vector DNA와 insert DNA를 ligase로 ligation해보고 대장균에서 그 형질을 발현
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