일반생물학실험 | 제한효소에 의한 plasmid DNA 절단 - 전기영동

 

 

 

TIP

 

 

전기영동의 원리를 이해하고, 직접 시험관 내 plasmid DNA를 전기영동하여 본다.

 

 

 

제한효소를 이용한 DNA의 절단 및 붙이기

제한효소 1 unit는 1 ㎍의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양이다. 상품화된 효 소는 효소마다 다르지만 대개 10 units/㎕ 내외의 농도로 공급된다. 제한효소 처리 반응은 절단하 려고 하는 DNA, 반응완충용액, 제한효소로 구성된다. 각각의 성분에 대하여 다음과 같은 점들을 고 려해야한다.

 

① 자를 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 제한효소 절단부위가 무수히 많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없을 것이다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 많은 효소를 넣어주기 때문에 그다지 걱정할 필요는 없다.

 

② Linear DNA의 끝부분을 자를 때는, 효소에 따라서 인식서열에 몇개의 염기가 더 붙어 있어야만 잘리는 것들이 있음을 주의한다. 이는 plasmid vector의 multiple cloning site를 두가지 효소로 자르는 경우에도 고려해야한다. 또한 PCR primer에 제한효소 인식부위를 넣어 design할 경우에도 반드시 고려해야 한다.

 

③ DNA의 순수도는 제한효소 처리 효율에 중요하다. DNA 용액 내에 단백질이 남아있는 경우는 보다 많은 양의 효소가 필요하다. Phenol과 같은 유기용매가 남은 경우는 제한효소에 잘리지 않는 DNA가 남는 경우가 많다.

 

④ 각각의 제한효소는 최적온도, 반응완충용액(reaction buffer)의 조성 및 불활성화 온도 등 각각에 알맞은 반응 조건이 있으며, 제조회사의 안내서에 이 내용이 잘 기록되어 있으므로 잘 읽어보고 사용해야 한다. 어느 회사의 제품이건 효소를 구입할 때 그 효소에 적합한 반응완충용액이 같이 지급되므로 별 어려움 없이 그대로 사용할 수 있으며 대개 10배 농축된 형태(10x)로 만들어져 있으므로 반응액을 조합할 때 10배 희석하는 형태로 반응액을 조성한다.

 

⑤ 반응 조건이 최적이 아닌 경우에는 더 많은 양의 효소를 사용해야 한다. 이는 두가지 이상의 효소로 자르는 경우 (효소들의 최적 조건이 다를 때)에 중요하다. 때에 따라서는 이런 경우에 star activity라 불리는 현상(비특이적으로 아무 곳이나 다 잘리는 현상)이 나타날 수도 있으므로 주의해야 한다.

 

⑥ 효소가 인식부위를 자르는 데에 있어서 같은 인식부위라도 주위 염기서열에 따라 그 활성도가 다를 수 있다. 그러므로, DNA 양으로 계산한 효소 양보다 조금 더 많이 넣어주는 것이 좋다. 필요할 때는 제한효소 처리 중에 조금씩 덜어 전기영동으로 monitor할 수도 있다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 0.1% agarose gel을 만든다.(0.2g agarose, 20㎕ TAE buffer을 넣고 전자렌지에 1분간 가열하여 agarose gel을 녹임.)

 

2) 녹은 agarose gel을 60℃ 정도까지 식힌 후 gel plate에 붓는다.

 

3) 30분 후 agarose gel이 굳은 것을 확인하고 comb를 살며시 빼고 1X TAE 완충용액으로 채워진 전기영동장치 내에 gel을 넣어둔다.

 

4) 준비된 제한효소로 자른 plasmid DNA에 3㎕ 3X loading dye를 넣어준다.

 

5) 총 15㎕의 DNA 용액을 micro pipette 을 사용하여 gel 위에 apply한다.

 

6) 나머지 두 개의 sample도 gel 위에 apply한다.

 

7) standard marker 10㎕를 gel 위에 apply한다.

 

8) 전기영동장치의 전원을 연결해 100V에서 약 30분간 수행한다.

 

9) 전기영동이 끝난 gel은 UV transilluminator 위에 놓고 확인한다.

 

10) 사진을 찍어 plasmid DNA의 형태 구조적 차이를 비교ㆍ관찰한다.

 

 

 

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