분자생물학개론 | 미생물 배양을 위한 배지(Culture Medium)

 

 

 

TIP

 

 

1. 미생물 분야와 배지개발의 역사
2. 배지(culture midium)
3. 미생물 성장 조건
4. 배지성분과 배양환경
5. 미생물 배지 제조법

 

 

 

1900년대 초기에 식물의 일부분을 떼어내어 배양하려는 시도로부터 조직배양이 시작되어 1930년대 초기내에서 뿌리를 유기시켰고 1930년대 후기에 당근과 같은 저장조직의 일부분을 배양하여 callus를 유기시켰다(Fowler와 Rayns, 1993). George와 Sherrington(1984)에 의하면 ꡒ1957년 Skoog와 Miller가 배지내 auxin과 cytokinin의 상호작용이 조직이나 기관 배양시 기관형성 및 분화에 영향을 주는 것을 발견ꡓ한 이후 여러 학자들이 배지 및 형태형성 등 식물세포의 전형성능에 관해 집중적으로 연구한 결과 조직배양 기술이 더욱 발전하였다.

 

식물이 건강하게 생육하기 위해서는 토양내에 있는 질소, 칼륨, 칼슘, 인산, 마그네슘 등의 다량원소 및 철, 망간, 아연, 붕소 등 미량원소의 무기성분이 적당히 흡수되어야 하듯이 조직배양에서도 마찬가지로 다량 및 미량원소가 충분히 흡수되어야 한다. 정상적인 식물인 경우 탄수화물이나 vitamin류 등은 광합성이나 외부환경을 통해 고정하여 대사작용에 이용하므로 토양이나 배지에 달리 첨가해주지 않아도 정상적인 생육이 가능하지만 조직의 일부분을 배양하는 조직배양에서는 무기성분과 더불어 인위적으로 sucrose나 vitamin류 등을 배지에 첨가하여 충분히 흡수될 수 있도록 조성해야 배양에 성공할 수 있다. 그래서 조직배양이 시작된 이래로 여러 연구자에 의해 약 260개 이상의 배지가 조성되어 이용되고 있다.

 

배양배지란 배양기(培養基) ·배양액(培養液)이라고도 한다. 즉, 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위해 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하여 다시 고화, 그 밖의 목적을 위한 물질을 가한 것, 배양기라고도 한다. 생물은 생존·발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질로서 다량요소·미량요소 등을 요구한다. 그 중 기체상으로 얻어지는 것을 제외하고는 모두 무기 또는 유기화합물로서 배지에 공급해 주어야 한다.

 

필요한 화합물은 독립영양 ·종속영양 등 영양 형식에 따라 여러 가지이다. 보통 영양원을 탄소원·질소원·무기염류·발육인자(비타민류) 등으로 나누어서 생각한다. 특히 발육인자와 관련하여 생물체에서 추출한 비교적 복잡한 조성을 가진 것을 주체로 한 경우를 천연배지(天然培地)라고 한다. 세균배양에는 육즙·혈청 등이, 곰팡이배양에는 맥아추출물 등이 흔히 사용된다. 이에 대하여 무기염류만 또는 구조가 확실한 탄소원 ·질소원을 가한 조성이 명확한 경우를 합성배지(合成培地)라고 한다. 대량 배양에는 액체배지가 적당하고, 주(株)의 보존이나 분리에는 한천 ·젤라틴 등을 가한 고형배지를 사용한다. 많은 종류의 세균을 포함하는 재료로부터 목적균을 추출하기 위한 배지를 선택배지라고 한다. 배지는 완전히 멸균한 후에 목적균을 심지 않으면 잡균이 증식될 염려가 있고, 배지를 보존하기 위해서도 반드시 멸균이 필요하다.

 

 

1. 미생물 분야와 배지개발의 역사

미생물학이란 학문은 일련의 중대한 발견에 의해 발전되어 왔다. Dutch의 현미경학자 Anton van Leeuwhoek는 서로 다른 물종류를 연구하는 동안 최초로 박테리아를 관찰하였다. 이 발견은 1676년, 런던의 Royal society에 의해 공표되었다. Anton van Leeuwhoek는 또한 오늘날 Giardia lamblia라고 불리는 기생충을 관찰하였다. 1967년, 필라멘트를 가진 진균의 발견은 Robert Hooke에 의해 이루어졌다.

 

미생물들이 시각적으로 관찰되어졌을 때 가장 중대한 논쟁거리는 성장과 생식에 대한 것이었다. 이 투쟁은 자발적 세대설에 기인하는데 이는 미생물이 자발적으로 자란다는 설이다. 이 논쟁은 루이스 파스테르의 연구가 발표될 때까지 몇 년동안 계속 되었다. 파스퇴르는 자발적 세대설이 미생물학의 발전을 위해서 타파되어져야 한다고 생각했다. 이 논쟁은 파스테르가 heat-sterilized infusion을 사용한 성공적인 실험후에도 여전히 남아있었다.

 

미생물학이 발전하기 위해서는 두가지 중요한 발달이 요구되었다. 첫째는 정교한 현미경, 둘째는 미생물을 배양하는 방법이었다. 정교한 현미경들은 16세기 말 독일에서 발명되었으나 그것은 현미경 안에 빛의 초점이 맞추어 지는 무색 렌즈가 19세기 초에 발견될 때까지는 사용되지 못 했다.

 

1719년, Leeuwhoek는 자연적으로 색을 가진 beet juice와 같은 시약을 사용하여 박테리아의 분리를 최초로 시도하였다. 1877년, Robert Koch는 메틸렌 블루를 사용하여 tubercle bacillus를 염색하는데 성공하였다. 이 발견은 열을 사용하여 개체 속으로 통과하게 하는 방법이었다. 2년 후에 덴마크 병리학자인 Hans Christian Gram은 그람 염색을 발명하였다. 그람 염색은 그람 양성과 그람 음성 박테리아를 분별하기 위해 여전히 광범위하게 사용되고 있다. 1860년 파스테르는 최초로 실험실 안에서 자라는 박테리아의 배양배지를 사용하였다. 이 배지는 이스트 가루와 설탕 및 암모니아 염으로 구성되었다. 1881년, W. hense는 그의 아내가 사용하는 한천을 박테리아의 성장을 위한 고체화시키는 물질로 사용하였다.

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진균과 기생충의 연구는 다른 미생물들보다 뒤떨어졌다. 1839년, ringworm은 진균에 의해 야기되는 최초의 인간의 질병이었고, 이후 아구창을 일으키는 원인이 Candida albicans라는 것이 밝혀졌다. 1910년에 Sabouraud는 병원성 진균의 성장을 돕는 배지를 소개하였다. 진균을 연구하는 과학자들의 흥미는 자주 농작물 보호와 연관된 경우가 많았다.

 

1887년에 페트리 디쉬라고 하는 간단한 기구는 미생물학에 혁명적인 발전을 가져다주었다. 페트리 디쉬가 발명됨에 따라 배양 배지의 성분을 연구하는데 초점이 맞추어 졌으며 이후 다양한 연구가 진행되었고, 과학자들은 미생물의 소화와 융해에 저항하는 gelatin 대신 한천으로  바꾸기 시작하였다. 면역에 대한 연구는 Robert Koch에 의해 tubercle bacillus가 발견 된 후에 시작되었다. 이 발견과 함께 박테리아에 의해 유발되는 질병이 알려졌다. 최초의 능동적 면역을 얻기 위한 연구는 1880년 파스테르에 의해 콜레라를 이용하여 시행되었다.

 

1928년 Alexander Fleming은 우연히 포도구균 배양시 mold spore가 증식하는 것을 관찰하였고 이를 토대로 페니실린을 발견하였다. 이후로 항생제에 대한 연구가 활발히 진행되었으며 1930년 후반 페니실린을 정제하고 항균 효과를 증명하였다. 페니실린의 상업적인 생산은 미국과 영국간의 전쟁계획동안 시작되었다. 이 계획은 발효산업과 생물공학의 시작이 되었다.

 

1930년 factor X와 V같은 성장 인자들은 박테리아의 영양에 중요한 것으로 인식되었고,  1950년대 초반, 대부분의 비타민은 co-enzyme으로 성격 지어졌다. 이러한 세부화된 정보는 과학자들을 생화학적 원리의 이해를 발전시키도록 하였다. 미생물학의 현격한 발전은 세계 2차 대전이 끝난 후에 시작되었다. 분자생물학, 생물공학과 유전자 연구가 발전되었다. 1941년까지 미생물학과 유전학은 red bread mold인 Neurospora crassa가 미생물의 생리학에 사용될 때까지 함께 발전해왔다. 박테리아 유전학의 연구는 항생제 내성의 발견이후로 급속히 진행되었다. 분자생물학의 탄생은 1953년 DNA 구조의 왓슨과 클릭에 의한 확립 후에 이루어졌다.

 

1953년 바이러스들은 Luria에 의해 현미경으로 안 보이는 물체로서 특이적인 살아있는 세포에 침입하여 각 세포들안에서만 생식이 일어나는 세포라고 정의되었다. John Enders의  바이러스 배양 연구는 백신의 발전을 이루어냈다. 엔더스는 바이러스는 chick embryo에서 성장할 수 있으며 연속적인 생식후에 질병을 일으키기 능력이 소실됨을 증명하였다. 이 연구를 기반으로 Salk는 폴리오 백신을 발명하였다. E. coli는 분자생물학에 크게 공헌하였다. 1973년 herbert Boyer와 Stanley cohen은 plasmid 형질 전환을 통해 재조합된 DNA를 만들어 내었다. 이들은 외부 유입 유전자는 살아있을 뿐만 아니라 유전자적 물질로 복사됨을 발견하였다. 이 연구와 비슷한 다른 연구들은 이 연구를 계기로 하여 생믈공학 분야의 혁명적인 발전이 시작되었다.

 

1980년대 장비들이 미생물 실험실에 도입되었다. 수작업으로 하던 동정, 감수성, 혈액배양 등의 업무들이 자동화 장비로 대체되었다. 미생물 분야의 기술과 장비의 급격한 발전이 진행되고 있으나 기본적인 배양배지와 성분들은 오늘날에도 가장 믿을 수 있고, 비용이 저렴한 방법으로 사용되고 있다. 훗날 지금의 검사실 종사자들은 배지의 냄새와 집락의 다양한 색상을 그리워할 것 같다.

 

 

 

[분자생물학]미생물 배양을 위한 배지(Culture Medium) 레포트