일반생물학실험 | 제한효소에(단일제한, 중복제한) 의한 DNA 절단

 

 

 

TIP

 

 

시험관 내에서 (in vitro) 유전자 조작을 행할 때 쓰는 가장 기본적인 도구인 제한효소 (restriction enzyme)와 제한효소의 제한기작을 알아보고 플라스미드를 제한 절편들로 잘라 다시 맞추는 과정을 수행한다.

 

 

 

Plasmid

박테리아의 chromosome DNA중에서 독립적으로 떨어져 나온 DNA를 말한다. 보통 Plasmid는 작은 원형으로 나타나며 이중 가닥 구조를 가진다. 자연 상태에서 Plasmid는 archaea와 eukaryote에 존재하며 주로 항생물질내성의 형질을 나타낸다. 또한 수평적 유전자 이동을 통해 한 bacteria에서 또 다른 bacteria로 혹은 다른 종의 핵으로 이동하는데 용이하다.

 

 

 

제한 효소(restriction enzyme)

제한효소란 DNA 분자의 특정 염기서열을 인지하여 이중가닥 DNA를 절단하는 균주 특이성을 갖는 endonuclease이다. 이것의 원래 기능은 세포 내로 침입해 오는 virus나 외래 DNA를 절단, 제거함으로써 그것이 복제되는 것을 막기 위한 박테리아의 자기방어 기구라 할 수 있으며, 자신의 DNA는 methylation시켜 외부의 DNA와 구분하여 보호한다.

 

제한효소는 크게 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ군으로 분류되며 우리가 흔히 쓰고 있는 것들은 회문구조를 가진 짧은 염기쌍(4 - 6개가 가장 흔함)을 인식하는 Ⅱ군에 속하는 효소이다. 제한효소는 세균의 세포로부터 분리하여 실험실에서 유전자를 포함하고 있는 DNA 조각을 조작하는 데 사용할 수 있다. 이 때문에 제한효소는 DNA 재조합 기술에서 필수적인 도구로 사용된다.

 

제한효소는 각기 알맞은 반응 조건을 가지며 반응 완충액 (reaction buffer)의 경우 염의 농도에 따라 low, medium, high salt buffer로 나누어진다. 이외에도 pH, 반응 온도, DNA와 효소의 양 등이 변수로 작용한다. 제한효소는 뉴클레오티드 염기들(이중나선의 DNA 분자를 이루는 4가지 기본 단위인 아데닌시토신티민구아닌)의 짧은 특정 배열을 인식한다. 이러한 부위들은 인식 배열(recognition sequence)이라 부르며, DNA 전체에 무작위적으로 분포하고 있다. 세균의 종류에 따라 제한효소가 인식할 수 있는 뉴클레오티드의 배열이 모두 다른데, 몇 가지 주요 제한효소의 인식 부위와 제한 조건들은 다음과 같다.

 

 

실험 방법

1. 단일 제한 (single digestion) : 한 가지 제한효소로 DNA를 절단하는 과정

1) 3개의 Eppendorf tube에 각각 EcoRI, BamHI, PstI 으로 표시한다.

 

2) 각각의 tube에 아래 표의 양 만큼 넣고, 용액이 잘 혼합되도록 vortexing한 후, microcentrifuge로 2-3초간 원심분리 한다.

 

3) 37℃ 항온 수조에서 30분 동안 반응시킨다.

 

4) 제한효소 반응액 중 9㎕에 1㎕의 6X DNA loading dye를 가하고 agarose gel 상의 well에 loading한다.

 

5) 50분간 100 volt의 전류를 통과해 전기영동을 한 후 카메라로 gel 사진을 찍는다. 전기영동에는 제한된 DNA 조각의 크기를 결정하기 위해 DNA size marker도 같이 전기영동 한다. 또한 불완전하게 절단된 DNA 가닥을 찾기 위해 효소처리를 하지 않은 플라스미드도 전기영동한다.

 

 

2. 중복 제한 (double digestion) : 두 가지 이상의 효소로 DNA를 절단하는 과정이다.

1) 2개의 Eppendorf tube에 각각 E+B, B+P 식으로 표시한다.

 

2) 각각의 tube에 아래 표의 양 만큼 넣고, 용액이 잘 혼합되도록 vortexing한 후, microcentrifuge로 2-3초간 원심분리한다.

 

3) 37℃ 항온 수조에서 30분 동안 반응시킨다.

 

4) 단일제한의 4), 5) 과정을 수행한다.

 

 

 

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