생명과학실험 | DNA cloning와 전기영동

 

 

 

플라스미드(Plasmid)는 환상 DNA 분자들이며 독자적으로 염색체를 복제할 수 있고, 또 크기는 세균성 염색체 크기의 0.05-10%에 해당한다. 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니며 또 플라스미드는 다른 종의 세포 내에도 전달된다. 이러한 특성을 이용하여 플라스미드는 유전공학에 폭넓게 이용되고 있다.

 

cDNA는 Complimentary DNA, 즉 상보적 DNA란 뜻이며, mRNA를 주형으로 하여 상보적인 DNA (cDNA)를 합성하는 효소인 Reverse Transcriptase를 mRNA에 A, T, C, G와 함께 첨가하여 적정 환경에 놓아두면 cDNA가 합성된다.

 

우선 mRNA를 reverse transcriptase로 처리하여 DNA copy를 만들고, cDNA에서 mRNA를 제거하고 DNA polymerase와 nucleotide와 culture하여 double strand로 만든다. 그리고 double strands의 cDNA를 plasmid vector와 결합시켜 cDNA library을 만들게 된다. 본 실험에서는 대장균의 plasmid를 isolation시킨 후, 인삼의 cDNA가 insert DNA로 Transformation되어 제한효소 처리를 하고 전기영동으로 그 결과를 확인하였다.

 

 

DNA 전기영동의 기본원리

DNA gel 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극 쪽으로 움직이게 되는 기본원리를 지니고 있다. 이때 DNA분자가 gel matrix사이를 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지고 gel matrix가 치밀할수록(gel %가 높을수록)늦어지며, 또한 DNA분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 supercoiled DNA는 circular DNA보다 빠르게 움직인다. gel의 재료는 agarose 나 polyacrylamide가 흔히 쓰이며 분리하고자 하는 DNA의 크기에 따라서 선택을 한다. agarose gel는 100bp이상 20kb까지의 DNA를 분리하는데 사용되며 polyacrylamide gel은 1kb이하 크기의 DNA를 분리하는데 이용된다.

 

 

 

실험 방법

1. Plasmid DNA Preparation Method

1) Cell Harvest in 2㎖, 8000rpm, 4℃, 5min

 

2) SolⅠ(Tris-EDTA) 200㎕ add – resuspend, vortex

 

3) SolⅡ(NaOH/SDS) 200㎕ add - gently invert, RT 5min

 

4) SolⅢ(KOAc-ice cold) 200㎕ add - gently invert, ice 15 min

 

5) 12000rpm 4℃, 10min

 

6) Supernatant transfer into new-tube 1.5㎖

 

7) isopropanol 0.7vol(420㎕) add – invert gently

 

8) 12000rpm 4℃ 30min

 

9) Descant supernatant

 

10) 70% EtOH 500㎕

 

11) 12000rpm 4℃ 10min

 

12) Descant supernatant with pipette

 

13) Dry

 

14) Tris or dH₂O30㎕

 

2. Digestion with Restriction enzyme

1) DNA를 제외한 나머지 mix

 

2) 18㎕ 씩 dispense

 

3) DNA add

 

4) 37℃ overnight

 

5) 1% agarose 전기영동

 

3. Electrophoresis

1) 1㎕ DNA(uncut) + 2㎕ 2x loading buffer

 

2) 20㎕ DNA(cut) + 2㎕ 5x loading buffer → loading

 

3) Marker 3㎕ → 100 volts, 30min, 5x TBE

 

 

 

DNA cloning와 전기영동 레포트