생명과학실험 | Protein Purification과 Electrophoresis(SDS-PAGE)

 

 

 

TIP

 

 

추출해낸 Protein을 Purification하여 원하는 단백질만을 얻어내는 방법을 알아보고, SDS-PAGE Gel을 이용해 Electrophoresis하여 직접 눈으로 확인한다.

 

 

 

친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)

1) 친화성 크로마토그래피는 단백질과 지지체 위에 결합되어 있는 ligand 사이의 특이한 화학적 상호작용에 기초로 하는 분리 방법

예) 효소-억제제, 항원-항체 반응

 

2) Ligand 와 단백질 사이의 친화성 결합은 분자의 크기와 모양에 특이적인 결합 (Specific binding)

 

3) Column 내 정지상에 단백질과 상호작용하는 ligand 를 결합시킨 지지체 사용

 

4) 친화성 크로마토그래피에서 ligand 를 붙일 때 고체 matrix 에 되도록 긴 ligand 를 붙이는 것이 좋음

 

5) 만약 ligand 가 지지체에 바로 결합되어 있다면 단백질과 같은 거대 분자는 입체 장애 때문에 ligand 에 접근할 수 없을 가능성

 

6) 종종 지지체와 리간드 사이에 팔 (arm 또는 spacer) 를 붙여 사용

 

7) 시료를 이 컬럼에 통과시키면 단지 한 특정 단백질 만 정지상에 binding

 

8) pH 를 변화시키거나 이온세기를 변화시킴으로써 결합되어 있는 특정 단백질 용출

 

9) 친화성 크로마토그래피에서 ligand 와 단백질 사이의 친화성이 너무 높거나 낮으면 좋지 않음

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) Ni Affinity Chromatography를 위해서 Column을 Discharge시킨다.

 

2) Column에 Ni resin 200ul를 넣은 후 흘려준다.

 

3) Binding Buffer인 20mM Tris, 100mM NaCl을 흘려준다.

 

4) 이렇게 완성된 Column에 Sample Protein을 2ml 넣어준다.

 

5) 넣고 반응 시간을 준 후, Column을 열어서 흘려주는데 이때 적정량을 EP tube에 받아준다.

 

6) 5번 과정이 끝난 후 Elution Buffer인 20mM Tris, 100mM NaCl, 400mM Imidazole을 넣고 흘려주는 것을 받아주면 된다.

 

7) 이렇게 얻은 Sample 1,2,3을 20ul씩 5X Sample Buffer 5ul와 섞어준 후 90℃정도의 온도에서 10분 가열해 준다.

 

8) 12.5% Separating gel과 3.9% Stacking gel을 각각의 용량에 맞게 첨가하여 SDS-PAGE gel을 만들어준다. 이 때 TEMED를 제일 마지막에 넣어주는데 이는 Radical을 생성하여 각 용액이 액체 상태에서 gel 상태로 polymerization하도록 하는 촉매제 역할을 해준다.

 

9) 각 Sample과 Marker를 Loading Buffer와 섞어준 후 바로 gel에 Loading해 준다. 그리고 Electrophoresis를 진행한다.

 

10) Electrophoresis를 진행한 후 gel을 꺼낸 후 coomassie blue R250으로 Staining해준 후 Microwave를 돌려준 후 다시 destaining 해주고 결과를 관찰한다.

 

 

 

Protein Purification과 Electrophoresis(SDS-PAGE) 레포트