유전학실험 | UV조사를 이용한 B-W균주의 돌연변이 유도 및 효소활성

미생물의 종류에 따라 적절한 배지를 선택하여 사용해야 하기 때문에 배지의 종류와 각종 배지의 제조방법들을 배워서 미생물의 생육조건과 사용목적에 따라 적합한 배지를 선택해야 한다. 그리고 세균 배양에 필요한 영양소가 포함된 배지를 만들어 목적 세균을 증식시킬 수 있고 완벽하게 멸균하기 위해 고압증기 멸균방법을 알아본다. 또한 UV를 이용하여 돌연변이를 유도해 생성되는 결과물을 관찰하고 돌연변이 된 균주와 모체의 차이점을 알 수 있는 실험법에 대해 알아보고, 효소 활성 확인 배지에서 효소활성여부 결과를 확인해본다.

 

 

모체와 돌연변이체의 차이점

첫 번째로 DNA 염기서열 차이가 있는데 돌연변이가 생기게 되면 DNA의 염기서열에 변화가 일어나서 문제가 발생되며 변화가 생긴 염기서열이 복제가 되면서 모체와는 다른 염기서열을 갖는 염기서열이 된다. 두 번째로 형성된 단백질의 차이가 있는데 돌연변이가 DNA의 염기서열에 변화를 주기 때문에 단백질 형성에도 변화가 있다.

 

세 번째로 효소 활성의 차이가 있다. DNA의 염기서열에 의해서 단백질의 아미노산 서열에도 변화가 오기 때문에 효소의 활성 차이가 나타난다. 네 번째 효소 기능의 차이는 DNA의 염기서열 변화에 의해서 아미노산 서열에도 변화가 와서 효소의 기능이 사라지거나 새로운 기능을 갖는 효소가 형성될 수 있다. 다섯 번째로 효소의 활성이나 기능의 변화로 효소에 의해 생산되는 2차 대사산물의 양 또는 종류가 변할 수 있다.

 

 

효소활성을 확인하기 위한 방법

clear zone의 크기양상을 보는 방법이 있다. clear zone은 효소와 기질의 반응인 효소기질 반응에 의해 효소가 이용할 수 있는 기질이 있다면 그 기질을 이용해서 clear zone이 생성된다. clear zone은 미생물의 생장이 억제되어 아무 균이나 미생물이 자라지 않는 지역으로, 균이 자라지 않는 깨끗한 paper disc 주위의 원무늬 생육 저해한이고, 보통 clear zone의 직경으로 크기를 나타낸다.

 

clear zone의 크기가 작아진 것은 효소가 적게 생겨 분해가 늦어졌다고 볼 수 있다. 즉, 효소의 능력(활성)이 낮아짐을 뜻한다. 반대로 clear zone의 크기가 커진 것은 효소가 많이 생겨 분해가 빨라졌다고 볼 수 있다. 즉, 효소의 능력(활성)이 높아짐을 뜻한다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 처음에 조별로 효소활성 배지를 만들어 놓는데 그 중에 5조는 α-amylase를 증류수 100㎖에 LB 2g과 soluble starch 0.5g 그리고 agar 1.5g를 넣어서 만들고 autoclave를 돌렸다.

2) 도말할 균인 B-W균 시험관에 들어있는 LB에 배양했다. 그리고 균을 도말할 배지인 LBA배지를 증류수 100㎖에 Luria Bertani media broth 2g과 agar 1.5g을 넣어서 만들고 autocalve에 돌리고 clean bench에서 petri dish 5개에 붓고 굳혔다.

3) 굳힌 후 LB배지에 B-W균 배양한 것을 으로 희석시켰다(균주 10㎕와 buffer 990㎕). 희석시킨 균을 굳힌 petri dish에 피펫으로 100㎕를 따서 접종한 후 삼각 봉으로 도말하였다. 이 때, 오염을 방지하기 위해 알코올램프 가까이에 두고 했다. 그 후 도말한 배지를 UV 조사를 0분,1분,3분,5분,7분 간격으로 쬐어주고 난 후, incubation 했다.

4) 이틀 후 배양된 균을 가지고 효소활성 실험을 진행하였다. uv조사 0분을 쬐인 것을 wild type으로 사용하고 UV조사 1분을 쬐인 것이 가장 colony가 많이 나와서 돌연변이 type으로 사용하였다.

5) α-amylase, Cellulase, Lipase, Protase(alkaline), Xylanase등의 다섯 종류의 배지에 각각 wild type과 돌연변이를 접종위로 colony를 1개씩 따서 일자로 긋고 난 뒤, incubation 시켰다.

6) 그 다음날, 효소 활성을 확인하는 방법에서 α-amylase를 확인하는 방법은 증류수 50㎖에 0.25g/KI 2.5g의 시약을 만들어서 α-amylase 배지에 붓고 10분후 시약을 버렸다.

7) 그리고 Cellulase, Xylanase 이 두 배지의 확인방법은 0.1% congo red(증류수 100㎖ 당 0.1g) 시약을 부어서 30분후에 시약을 버리고, 1M의 NaCl을 붓고 15분후 버렸다.

8) Lipase, Protase는 있는 그대로 관찰을 하고, 시약을 이용해 확인한 배지들은 LED판에서 관찰했다.

 

 

 

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