분자생물학실험 | RNA의 추출과 정량

 

 

 

TIP

 

 

1. DNA 및 RNA의 구성성분의 차이점은 DNA는 thymine 및 deoxynibose를 함유하고, RNA는 uracil 및 ribose를 함유하고 있는 점이다.
2. 본 실험은 DNA, RNA를 각각 추출하고, UV를 통해 정량해 보았다.
3. 또 RNA는 RNA northern을 이용해 확인해 보았다.

 

 

실험 방법

1. RNA 추출

1) Mouse를 경추탈골(cervical dislocation) 시킨 후 간을 꺼낸다.

 

2) 무게를 재어 50mg 씩 2㎖ tube에 나눠 넣는다.

 

3) Polytron을 이용하여 간을 잘게 부순다.

 

4) TRIzol reagent 1㎖을 가하고 실온에서 5분간 방치한다.

 

5) Chloroform 0.2㎖(/1㎖ TRIzol)을 가하고 45초간 강하게 흔든다.

 

6) 실온에서 2～3분간 방치한다.

 

7) 12,000rpm 4℃에서 15분간 원심분리한다.

 

8) 상층액을 새 tube에 옮긴 후 isopropyl alcohol 0.5㎖(/1㎖ TRIzol)을 가해 위 아래로 잘 저어 준 뒤 상온에서 10분간 치한다.

 

9) 12,000rpm 4℃에서 10분간 원심분리한다.

 

10) 상등액을 버리고 RNA pellet을 DEPC 처리한 75%EtOH 1㎖을 가하고 tapping 후 12,000rpm 4℃에서 5분간 원심분리한다.

 

11) 상등액을 버리고 나머지 RNA pellet을 10분간 실온 건조한다.

 

2. RNA 정량

1) RNA pellet을 0.1% DEPC water로 녹이고 resuspension한다.

 

2) sample 2㎕를 취해 0.1% DEPC water 1㎖을 가해(500배 희석) UV로 정량한다.( = 1은 40㎍/㎖)

 

3. RNA 확인

1) RNA northern kit을 조립한 후 수평을 맞추고 DEPC water를 부어 놓는다.

 

2) Agarose gel 40㎖을 만든다.

 

3) 잘 저어준 후 거품이 없어질 때까지 기다렸다가 gel을 붓고 굳힌다.

 

4) RNA 10㎍에 loading buffer 2㎕를 가한다.

 

5) 65℃에서 10분간 incubation한다.

 

6) 1×MOPS를 붓고 40V에서 10～15분간 prerunning 시킨다.

 

7) Well에 sample을 loading한다.

 

8) 70V에서 90분간 running 시킨다.

 

9) gel을 꺼내 RNA band를 확인하고, scan한다.

 

 

 

[분자생물학실험]RNA의 추출과 정량 레포트