생명과학실험 | Alkaline phosphatase의 정제

 

 

 

TIP

 

 

Ion-exchange chromatography에 의한 단백질 정제 원리를 이해하고, DEAE anion exchange column을 이용한 AP 단백질의 정제기법을 습득하게 된다.

 

 

 

Alkaline Phosphatase(AP)

Phosphatase는 인산화 되어 있는 분자에서 인산기를 제거하는 효소이다. 대개 생체내의 효소는 특정한 기질과만 반응하는 기질 특이성을 지니는데, AP같은 경우에는 특정한 기질과만 반응하지 않는 nonspecific phosphatase에 해당한다. 이름에 alkaline이 붙는 이유는 이 효소가 작용할 수 있는 최적의 환경이 염기성이기 때문이다. AP는 보통 homo-dimer로 작용하며 크기는 140-160 kDa정도이다. (-)charge를 띠며, 75～85℃의 온도에서도 activity를 유지한다.

 

 

Ion-exchange chromatograpy (이온 교환 크로마토그래피)

이온 교환 크로마토그래피는 주어진 pH에서 단백질이 가지는 순 알짜 전하의 하전성과 전하량의 차이에 의해 분리하는 방법이다. 관 속의 기질은 합성 중합체(resin)로서 전하를 띤 기를 가지고 있다. 양이온 기를 가지는 경우 양이온 교환체(cation exchanger), 음이온 기를 가지는 경우 음이온 교환체(anion exchanger)라고 부른다. 각 단백질의 관 내 이온기에 대한 친화도는 pH(분자의 이온화 정도를 결정해주는)와 용액 내의 경쟁적 유리 염 이온들의 농도에 의해 영향을 받는다.

 

기질에 결합된 단백질의 분리는 이동상(용액)의 pH, 염 농도를 단계적으로 변화시켜 pH나 염의 농도 기울기를 구축하면 분리를 최적화 시킬 수 있다. 본 실험에서는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용했는데, 고체 기질 DEAE는 양이온을 띠는 작용기를 갖는다. 이 경우, 알짜 음전하를 띠는 단백질은 고정상과의 상호작용에 의하여 알짜 양전하를 띠는 단백질보다 이동속도가 지체 될 것이다. 이와 같은 원리를 통해 음전하를 띤 AP 단백질을 정제할 것이다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 각 fraction을 받을 10개의 e-tube(microtube)를 준비한다. 각 튜브에 이름을 쓰고 500㎕ 지점에 표시를 한다.

 

2) AP가 당연히 있을 것으로 예상되는 positive control 로써 원액 enzyme solution을 덜어 PM이라고 쓴 튜브에 넣고 ice에 보관한다.

 

3) bead와 buffer가 1:1로 섞여있는 Slurry bead 1㎖을 column에 넣는다.

 

4) Column의 마개를 연다.

 

5) column에 slurry를 loading한다.

 

6) bead volume의 10배의 Tris-HCl buffer을 1회에 1㎖씩 사용하여 bead를 wash해 준다.

 

7) 마지막 wash를 할 때에 bead를 packing해 준다.

 

8) 즉, 다시말하면 column에 loading한 bead를 washing한다. bead의 10배(5㎖)를 1㎖씩 5번 washing한다. 5번의 washig이 끝난 후 column의 입구를 막고 packing한다.

 

9) Protein mixture (PM)를 1㎖씩 2번 column에 넣어준다.

 

10) Column에서 용액이 떨어지기 시작하면 Negative control로 사용할 Flow through (FT)를 e-tube에 500㎕ 받아준 뒤 나머지는 비커에 따라 버린다. 또 positive control로 사용할 Protein AP mixture를 따로 e-tube에 200λ 담아준다.

 

11) 즉, DEAE column에 protein solution을 loading한다. 그리고 용출 되는 flow through(FT)를 AP가 없을 것으로 예상되는 negative control로써 덜어 e-tube에 넣고 ice에 보관한다.

 

12) Bead washing을 1㎖씩 10회 수행해 주며 마지막 wash를 수행 할 때 bead packing을 해 준다.

 

13) 즉, elution을 하기 전에 bead washing을 통해 bead 사이에 남아 있을 미지의 단백질들을 제거한다. Bead의 6배(3㎖)를 1㎖씩 washing하고 packing한다.

 

14) Bead가 흐트러지지 않게 조심하며 30mM NaCl을 column에 1㎖ 넣어준다.

 

15) 아래로 흐르는 용액은 500㎕씩 e-tube에 나누어 담는다.

 

16) 즉, protein elution : bead의 2배(1㎖)를 loading 하되, (1)에서 미리 준비한 e-tube에 각각의 fraction을 따로 차례로 담아 보관한다.

 

17) 7), 8)과 같은 과정을 100mM, 150mM, 200mM NaCl으로도 수행해 준다.

 

18) Bead regenerartion

 

 

 

[생명과학실험]Alkaline phosphatase의 정제 레포트