일반생물학실험 | Measurement of Microbiological Activity and Growth - Bacterial Growth by Plate Counting

 

 

 

TIP

 

 

Plate Count 법
각종 배지와 부란조건을 사용한다. 호기적으로 생육하는 미생물은 그 현탁액을 적당히 희석하여 적절한 조건하에서 평판배양(Plate Count)하여 생긴 Colony의 수로부터 생균수를 측정하는 평판배양법(Plate Count Method, Colony Count Method)을 많이 사용하고 있다. 이에따라 현탁액을 희석하여 평판배양을 한 후 Colony Counter를 이용하여 생균수를 측정하고자 한다.

 

 

 

모든 생존계수법은 미생물에 선택적이며, 선택성의 정도는 생존수 계수방법에 따라 다르다. 이 선택성은 기술적으로 모든 미생물을 배양할 수 있는 보편적인 배지를 만들수가 없기 때문에 이러한 선택성을 최소한도로 줄이는 방법은 가능한 많은 종류의 미생물을 배양할 수 있는 보편적인 배지를 개발하는 일이다.

 

 

Colony 형성

한 개의 따로 분리한 세균 세포가 고체배지 표면 또는 그 내부에서 번식하게 되면 이 번식한 세포들이 한 곳에 세포의 무리를 이루어 축적된다. 이것을 Colony 라고 한다. Colony 생장성질은 Colony를 이루고 있는 각 세포성질과 Colony가 발달하는 환경에 의해 결정된다. 세균에 있어서는 세가지 형태의 Colony 생장이 있다. 이세가지는 Eibacteria, Mtxobacteria, Acnomycetes들이 각각 갖는 독특한 형태이다.

 

1) 진정세균의 Colony 형성

진성세균의 군락은 일반적으로 세포가 조밀하게 밀접된 집단으로 발달하며, 초기에는 세포들이 매우 근접하여 축적되기 때문에 생장차원이 매우 복잡하며, 이것은 매우 근접해 있으므로 생리적 혼잡상태(Physiological Crowding)라고 하는 상황을 이룬다. 이때 각세포들이 서로 경쟁하여 유효성분을 섭취하며 배설물의 축적에 의하여 서로 영향을 준다. 세균군락의 생장은 군락 내부에서 일어나는 세포상호간의 작용에 의해서 영향을 받을 뿐 아니라, 주위에 있는 다른 군락의 상호작용에 의해서도 영향을 받는다. 또한 각 군락들이 매우 가까이 있게 되면 배지에 존재하고 있는 필요한 영양분의 고갈과 유독성 대사산물에 의해 서로 군락발달을 방해하게 된다. 도말 평편상에서 분산이 잘된 군락은 그 크기가 크지만 서로 밀접한 군락은 작아진다.

 

2) 점질세균의 Colony 형성

진정세균의 대부분 군락생장이 수동적인 것에 반해 점질세균의 경우는 군락형성이 항상 적극적이며, 이는 세포들이 고체배지의 평면에서 포복운동(Creeping movement)을 하여 퍼져 나갈 수 있기 때문이다. 이런 식으로 매우 얇지만 빠르게 퍼져 나갈 수 있기 때문이다.

 

3) 균사체의 생장

균사체를 형성하는 미생물에서 한 개의 균사가 적당한 배지에서 발달하게 되면 균사의 길이가 시간이 경과함에 따라 점점 더 길어지게 된다. 균사 길이의 증가는 항온처리 시간에 비례하게 되며, 균사의 길이를 시간에 대하여 변화하는 도표로 나타내 보면 직전이 된다. 균사를 형성하는 미생물이 고체 배지 표면에 얇은 원형의 군락을 형성하여 성장할때는 좀더 복잡해 진다.

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실험 방법

1. Dilution Procedure

1) 멸균된 1㎖ pipette으로 시료 1㎖를 취하여 희석액이 든 희석병 (Blank 1)에 가하고 미생물이 균일하게 분산되도록 잘 흔든다.

 

2) Blank 1에서 다른 희석병(Blank 2)에 또 다른 멸균된 1㎖ pipette으로 1㎖를 취해 가하고 미생물이 균일하게 분산되도록 잘 흔든다.

 

3) 이 과정을 여섯 번까지 반복한다. (단 Drinking Water, C.N.U. Pond. 유성천등은 각각 다른 희석율로 한다.)

 

2. Plating Peicedure

1) 미리 만들어 놓은 Typton Glucose Ectract Agar(액체상태의 것)를 Petridishdnl에 부어 평판배지를 만든 다음 이것을 Incubator 속에서 30분간 뚜껑을 약간 연채 말린다 (접종액이 잘 흡수 되도록).

 

2) Petridish에 시료의 종류, 희석비율등을 기록하고, Blank 6에서 멸균된 0.1 ㎖ Pipette으로 0.1 ㎖를 취하여 Petridish에 가하고 drigalshi Spatula로 골구로 분산시킨다.

 

3) 이런식으로 각각의 Vlank에서 위와 같은 과정을 되풀이 한다. 이때 각 단게에서 동일한 Pipette을 사용하여 희석비율이 높은 Vlank 6부터 시작한다.

 

4) Petridish을 30℃ incubator 속에서 24시간동안 배양한다.

 

3. Counting and Calculation

1) 24시간동안 배양한 petridish을 꺼내 희석배율순으로 Table 위에 놓고 서로 비교한다.

 

2) Colont 수가 30 ～ 300의 범위로 생성된 것을 골라 Mechanic Counter로 Colony의 수를 센 다음 ㎖ Sample당 세균수를 계산한다.

 

 

 

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