일반화학실험 | HPLC에 의한 아데닌과 카페인의 분리

 

 

 

TIP

 

 

1. 혼합물을 이룬 여러 가지 물질을 알아내고자 할때 사용하는 방법 중 하나인 크로마토그래피는 다양한 분야에서 활용되고 있는 도구이다.
2. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 아데닌, 카페인의 구조와 elution time과의 관계를 알아보고, 각각의 흡수 스펙트럼을 얻은 후 커피 한 잔에 포함된 카페인을 정량해본다. 본 실험을 통해 극성, 무극성, 분자간 상호작용의 개념을 체험적으로 학습한다.
실험 1을 통해 아데닌과 카페인의 구조와 그에 따른 극성 정도를 비교
실험 2을 통해 아데닌과 카페인이 가장 최대로 흡수하는 파장의 빛을 흡수하는 지 알아본다.
실험 3을 통해 농도비와 흡광도 비를 관련하여 커피 용액에 함유되어 있는 카페인의 양을 구하고, 이에 관련된 법칙을 구해보자.

 

 

 

츠벳의 식물 색소 분리로 출발해서 밀러의 아미노산 분석, 샤르가프의 염기 분석을 가능하게 했던 정상 크로마토그래피는 역상 크로마토그래피로 발전해서 지금은 전 세계적으로 수많은 화학 연구실, 약품, 식품 및 환경 분석실에서 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatogrpahy, HPLC) 방식으로 사용되고 있다.

 

분리된 화합물의 검출도 in-line으로 이루어진다. 가장 많이 분리되는 유기화합물들은 대부분 자외선을 흡수하기 때문에 HPLC에서도 UV detector가 많이 사용된다. 이 실험에서는 자외선을 흡수하면서 구조적 차이 때문에 역상 크로마토그래피로 분리가 잘 되는 아데닌과 카페인을 분리, 정량하고 자외선 스펙트럼의 차이를 아울러 관찰한다.

 

 

화학에서 혼합물을 이루는 여러 물질을 알아낼 때는 많은 방법을 사용한다. 화학에서 사용되는 분리 방법에는 침전, 여과, 확산, 원심분리, 증류, 용매 추출, 전기영동 등 여러 가지가 있지만 그 중 크로마토그래피는 다양한 분야에서 널리 활용되고 있는 유용한 도구이다. 크로마토그래피는 한 번에 많은 물질을 분리할 수 있고, 미량의 물질을 분석 및 분리가 가능하므로, 요즈음 가장 많이 사용되는 중요한 분리 방법의 하나이다.

 

HPLC란 High Performance Liquid Chromatography의 약자로써 고성능 액체 크로마토그래피라고 한다. HPLC는 일반적인 액체 크로마토그래피에서 입자는 더욱 작게하고 더욱 가는 컬럼을 사용한다. 이때 느려지는 액체의 통과속도를 보정하기 위해 적절한 고압을 가하여 기체 크로마토그래피와 같은 속도로 뛰어난 분리 능력을 얻을 수 있다.

 

본 실험에 사용 된 역상 액체 크로마토그래피에서는 옥타데실기(C-18기)처럼 긴 탄화수소 사슬이 공유결합으로 결합된 막을 입힌 작은 입자를 정지상으로 사용하고, 물과 유기용매(실제 실험 물 60%+메탄올 40%)를 섞어서 극성을 조절한 혼합용액을 이동상으로 사용한다. 역상 크로마토그래피의 원리는 극성이 다른 색소의 혼합물을 C-18 카트리지에 통과시키면 극성이 작은 색소는 C-18기와 상호작용을 하기 때문에 정지상에 오래 머물게 되고, 물과 상호작용을 더 잘하는 극성이 큰 화합물은 물을 따라 먼저 흘러나오게 된다.

 

정상크로마토그래피에 비해 역상크로마토그래피의 장점은 뛰어난 분리를 얻을 수 있으며, 극성 물질이 극성충전물에 흡착되어 일어나는 봉우리 꼬리끌기 현상을 제거할 수 있다. 뿐만 아니라 용리액에 포함되는 극성 불순물에 덜 민감하기 때문이다.

 

본 실험에서는 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography; HPLC)와 UV detector를 이용하여 카페인과 아데닌을 검출해 보고, 카페인과 아데닌의 혼합용액을 이용하여 각각의 물질이 어떤 파장에서 좋은 결과를 보이는지 확인한다. 또한 농도가 다른 카페인 용액을 이용하여 농도와 흡광도 사이의 관계를 찾아봄으로써 궁극적으로 커피 속에 포함되어 있는 카페인의 농도를 추정할 것 이다.

728x90

 

 

실험 방법

실험 1. 아데닌과 카페인의 분리

※ HPLC에 아데닌 용액과 카페인 용액을 각각 넣어 elution time(용리 시간)을 관찰하고 아데닌과 카페인의 구조와 elution되는 시간과의 관계를 생각해본다.

1) 15 ㎖ test tube에 미리 준비된 300 μM 아데닌과 500 μM 카페인을 2 ㎖씩 담아온다.

 

2) 프로그램의 수집시간을 5분으로 설정한다.

 

3) 측정파장을 260 ㎚로 설정한다.

 

4) 시험관에 덜어 온 아데닌 용액으로 헤밀톤 주사기를 한번 헹군다.

 

5) detector의 프로그램 설정에서 시료의 이름을 설정하고 ‘수집분석 준비’ 상태로 셋팅하여 둔다

 

6) 아데닌 용액 중 80 μL을 공기가 주입되지 않게 주의하면서 20 μL injection loop를 채우도록 한다. 핸들을 오른쪽 inject 방향으로 재빨리 끝까지 돌리면 run이 시작된다.

 

7) 5분 동안 아데닌 용액의 크로마토그램을 얻는다.

 

8) 같은 방법으로 카페인의 크로마토그램을 얻는다.

 

 

실험 2. 아데닌과 카페인의 흡수 스펙트럼

※ HPLC에 아데닌 용액과 카페인 용액을 섞은 용액을 넣고 파장을 변화시켜 아데닌과 카페인의 흡광도에 변화를 관찰해본다.

 

※ HPLC로 어떤 미량의 화합물을 검출하고 정량적으로 분석하려면 빛을 최대로 흡수하는 파장을 선택하여 감도(sensitivity)를 최대화 하는 것이 바람직하다. 아데닌과 카페인의 흡수스펙트럼을 얻어 보자.

1) 덜어 온 아데닌과 카페인 용액을 1 ㎖씩 취해서 mixed sample을 만든다.

 

2) 프로그램의 제어목록에 시료를 파장별로 추가한다.

 

3) mixed sample를 헤밀턴 주사기로 injection하여서 250, 260, 270, 280 ㎚에서 차례로 크로마토그램을 얻는다.

 

실험 3. 커피에 들어있는 카페인의 정량분석

※ 카페인 용액의 몰농도를 변화시켜 각각의 흡광도를 분석하고, 이를 이용해 커피의 함유되어 있는 흡광도와 비교해 커피의 함유되어 있는 카페인의 양을 비교해본다.

 

※ 두 티스푼 의 동결건조커피를 (700㎎) 100 ㎖의 물에 넣은 커피 한 잔 (종이컵 기준)에 들어 있는 카페인을 정량해 보자.

 

1) 500 μM 카페인 용액을 증류수와 methanol의 60:40 (v/v) 혼합용액(전개액)으로 묽혀서 각 2 ㎖의 125, 250, 375 μM 카페인 용액을 만든다. (500 μM을 절반으로 묽혀서 250 μM을 만들고, 이를 500 μM과 반반 섞으면 375 μM이 되고, 전개액과 혼합하면 125 μM가 된다.)

 

2) 1/10로 묽힌 커피 한 잔' 용액을 1 ㎖씩 덜어 온다.

 

3) Detector의 파장을 270 ㎚, 수집시간을 5분으로 설정한다.

 

4) 125, 250, 375 μM 카페인 용액의 크로마토그램 데이터를 얻는다.(standard curve 500 μM의 카페인 크로마토그램은 실험 1의 데이터를 활용)

 

5) 커피 용액의 크로마토그램을 얻어서 농도를 확인한다.

 

 

 

[일반화학실험]HPLC에 의한 아데닌과 카페인의 분리 레포트