일반생물학실험 | 식물색소의 분리 및 광학적 정성분석

 

 

 

TIP

 

 

시금치잎으로부터 chromatography를 해서 색소를 분리해내서 value를 구한다. 그리고 먼저 측정한 spectrum으로부터 661.6, 644.8, 470㎚에서의 흡광도를 찾고 농도를 계산하고 chromatography로 추출한 각 색소의 band가 무엇이었는지를 알아본다.

 

 

 

엽록체의 구조

내막이 변형된 얇은 막이 여러층 포개져 있는 라멜라구조를 이루며, 라멜라의 일부가 부 풀어 형성된 납작한 주머니 모양(원반상)의 틸라코이드(thylakoid)가 있다.

 

원반상의 틸라코이드가 층층이 쌓여 동전을 쌓아 놓은 것과 같은 그라나를 이루며, 그라 나 주위의 기질로 채워져 있는 공간을 스트로마라 한다.

 

① grana thylakoid : 틸라코이드가 서로 중첩된 라멜라(lamella), 광합성 색소들이 존재

② stroma thylakoid : 중첩됨이 없이 확장된 막, 환원에 참여하는 효소들이 존재

 

 

광합성색소

고등식물의 주된 광합성 색소는 chlorophylls과 carotenoids의 두그룹으로 나뉠 수 있다. 이 두가지 색소는 모두 엽록체의 그라나 틸라코이드막 속에 존재하며 태양의 빛에너지를 흡수할 수 있다. 비교적 약한 비공유결합을 하고 있는 색소 단백질 결합체는 polyacrylamide gel electrophoresis와 isoelectric focusing으로 분리되어 분석이 가능하다. 식물색소는 acetone, methanol, hexane과 같은 용매에서 식물조직을 갈면 단백질로부터 분리된 형태로 추출된다. chlorophylls과 carotenoids는 유기용매에 잘 용해되므로 생화학적으로 lipids로 분류된다.

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실험 방법

1. extraction of the pigments

1) mortar에 깨끗한 시금치잎 10장, 100% acetone 15㎖, pure sand 0.5g을 넣고 solution 이 진한 청녹색이 될 때까지 갈아준다.

1) anhydrous sodium sulfate 3g을 넣고 조금 더 갈아준다.

 

2) funnel과 filter paper를 이용하여 total extraction solution을 15㎖ tube에 받아낸다.

∙ total extract의 volume이 5㎖이 되도록 acetone을 funnel속에 조금씩 넣어준다.

∙ 시금치의 진한 녹색이 흐려질 때까지 약 10㎖ 정도를 넣어준다.

 

3) 불용성 성분의 제거를 위해 4℃의 microcentrifuge에서 14000rpm으로 10분간 원심분리 한 후, 상층액을 새 tube에 담는다. (centrifuge 할 때에는 1.5 ㎖ tube에 1㎖씩 담아서 한다.)

 

4) 정량분석을 위해 661.6, 644.8, 470 ㎚에서의 흡광도를 측정한다. 또한, 정성분석을 위해 350～700㎚에서의 spectrum을 측정한다.(error range를 벗어나기 위해서는 흡광도가 0.5～1.5 정도가 되도록 100% acetone으로 희 석하여 측정하는 것이 좋다. 희석 후, 불용성 성분이 더 많아지므로, 원심분리하여 상층 액만 새 tube에 담아 측정한다.)

 

5) total extract를 chromatography paper(14㎝ × 10㎝)의 긴 변의 바닥에서 1.5㎝ 떨어 진 곳에 양 끝에 약 1㎝의 여백을 두고 고르게 가느다란 선을 이루며 점적한다. (50 ㎕ 씩 10회이상 dryer로 말려가면서 점적한다. 이때 선이 두꺼워지지 않게 주의한다. 선이 진한 녹색이 될 때 까지 반복한다.)

 

6) chamber에 solvent (petroleum ether : acetone = 9 : 1)를 ～0.7㎝ 높이가 되게 채우고, 점적이 끝난 chromatography paper를 점적한 선이 원을 이루게 둥글게 말아 stapler로 고정한 뒤 chamber에 세워 전개시킨다. 끝에서 0.5㎝정도까지 전개가 되면 chamber에 서 꺼내 말린다.

 

7) 전개용매의 전개높이와 각 band의 전개높이를 측정하여 Rf value를 구한다.

 

8) 색이 나타난 각 band를 길게 잘라내고 각각 잘게 잘라. 2㎖의 100%acetone이 들어있 는 15㎖ tube에 각각 넣고, 뚜껑을 닫아 추출해낸다. (2분마다 흔들어주면서 10～20분간 추출한다.)

 

9) 추출한 각 색소를 350～700㎚에서 spectrum을 측정, 비교하여 각 band가 어떤 색소인 지를 유추한다. (error range를 벗어나기 위해서는 흡광도가 0.5～1.5 정도가 되도록 희석하여 측정하는 것이 좋다. 희석 후, 불용성 성분이 더 많아지므로, 원심분리하여 상층액만 새 tube에 담 아 측정한다.

 

 

 

 

[일반생물학실험] 식물색소의 분리 및 광학적 정성분석 레포트