세균생장에 대한 온도의 효과를 설명하고, 미생물 생장에서 pH의 효과를 알아볼 수 있다.
우리는 인위적으로 미생물을 죽게 하거나 번식을 억제함으로써 미생물의 생육을 조절하여 식품의 저장기간을 늘리거나 식품의 부패를 방지할 수 있다. 미생물의 생육에 영향을 미치는 요인은 온도, 수분활성도, pH, 산화환원전위, 산소, 영양소 등이 있다. 이러한 요소들 중, 중요도가 높은 것은 온도, 수분활성도, pH이다.
이들은 각각 따로 영향을 미치는 것이 아니라 서로 밀접한 관련을 갖고 복합적으로 미생물의 생육에 영향을 미친다. 미생물은 자연환경에서 한 종류만 자라지 않고 다양한 미생물집단으로 자라면서 서로서로 생육에 영향을 미치기 때문이다. 이와 같이 본 실험에서는 온도와 pH가 생물 생장에 미치는 영양에 대해 확인해 보았다.
온도는 모든 생물체의 생장과 생존에 영향을 미치는 중요한 요소 가운데 하나이다. 모든 생물체는 생장하는데 가장 적합한 온도를 가지는데 이 온도를 최적온도라 하며 이 온도보다 높거나 낮으면 보통 생장률은 감소한다. 온도는 효소활성에 영향을 미치며, 효소들은 미생물에서 일어나는 모든 생화학반응들에 관여된 단백질 분자들이다.
미생물들은 지구상의 대부분 온도에 적응해 왔다. 0℃에서 20℃사이에서 가장 잘 증식하는 미생물들을 저온성미생물 (psychrophiles)이라 불리며, 저온성세균은 냉장고 (5℃)에서도 잘 생육해서 우유와 같은 음식을 상하게 한다. 저온성 미생물과 같은 몇몇 위험한 세균들은 냉장고 음식에서 증식하여 설사를 일으키는 독소들을 생산해 낸다.
또 다른 부류의 미생물은 중온성 (mesophilic) 또는 중온균 (mesophiles)으로 표현되는 것들이다. 이들은 20℃에서 45℃ 사이의 온도에서 가장 잘 증식한다. 인간을 포함해서 온혈 동물의 체온이 약 37℃이기 때문에 중온균은 체내에서 잘 증식하며, 대부분의 인체병원균은 중온균에 속한다. 높은 온도에서 증식하는 미생물들을 고온성 (thermophilic) 또는 고온균 (thermophiles)이라 부른다. 이 미생물들은 45℃ 이상의 온도에서 증식한다.
미생물의 생육은 외부환경의 pH에 의해서도 영향을 받는다. 미생물에게 최적의 온도가 있는 것처럼 미생물 종류에 따라 가장 적합한 최적의 pH가 있다. 일반적으로 식품 중 과일은 pH가 낮고 채소류, 육류 등은 pH가 높다. 식품은 대부분 산성이나 중성이므로, 식품과의 관련을 생각할 때는 최적 또는 최저 pH가 중요하다. 곰팡이와 효모는 pH 2-8.5의 넓은 범에서 생육할 수 있으나 대체로 약 산성을 좋아하며, 최적 pH는 4-6이다. 반면 대부분의 세균과 방선균은 중성부근에서 약알칼리성 즉, pH 7-7.5에서 잘 발육하고, 일반 부패균은 pH 5.5 이하에서는 거의 생육을 못하고 식중독균은 더욱 예민하여 극히 예외인 경우를 제외하고는 생장과 독소를 생산할 수 없다.
미생물의 발육 또는 생장은 세포 구성 성분과 구조의 양적 증가라고 정의 할 수 있다. 일반적으로 개별적인 세포의 발육과 집단발육을 구별하는 것이 편리하다. 개개 미생물의 세포발육은 그 크기와 무게의 증가를 가져오며 세포 분열의 전단계를 의미하나, 집단발육은 세포분열에 의한 세포의 수적 증가를 의미한다. 미생물은 대부분 크기가 대단히 작은 생물이므로 세포의 발육에 대하여 연구하는 것은 매우 어려운 조건을 수반하기 마련이므로 대부분의 경우 주로 집단발육에 대하여 다루고 있다. 미생물의 증식도를 측정하기 위한 방법으로는 건조 균체량 측정법, 균체 질소량 측정법, 원심 침전법, 총균계수법, 광학적 방법이 있다.
본 실험에서는 광학적 방법 중 하나인 비색법을 이용하였다. 비색법은 균 현탁액으로 빛의 흡수를 측정하는 것으로, 일반적으로 600 ㎚ 부근의 적색광의 흡수를 측정하는데 흡광도 (absorbancy, optical density, O.D)로 표시한다. 이 방법은 매우 쉽고 유용한 증식판정법으로 세포가 자라면 배양액이 탁해지고 세포는 빛의 투과를 방해한다는 원리를 이용한 방법이다. 세포가 많으면 많을수록 투과도는 낮아지기 때문에 흡광도는 세포수의 증가와 비례하여 커진다. 또한 pH에 따른 미생물 증식 측정시 pH 조절에 사용했던 기기는 pH meter이다. pH는 수소이온의 농도를 나타내므로 이것은 용액 중에 직접 또는 간접으로 두 개의 전극을 삽입하여 전지를 형성하고, 이에 따라 나타나는 전위차를 측정하여 이 값을 pH로 나타나도록 한 장치가 pH meter이다.
미생물의 생육에 영향을 미치는 환경요인을 아는 것은 발효식품의 제조 등 미생물산업을 이해하는 데 매우 중요하고 식품보존방법의 원리를 이해하며 식중독을 예방하는 데 필수적인 지식이다. 열을 가하거나 냉동이나 냉장과 같이 온도를 낮추어 미생물의 생육을 억제하는 방법, 또는 pH 조건을 변화하여 미생물의 번식을 억제하는 방법 등과 같이 매우 중요하게 적용된다. 따라서 이번 실험의 목적은 세균생장에 대한 온도의 효과를 설명하고, 미생물 생장에서 pH의 효과를 알아보기 위한 것에 있다.
Growth of microorganism is affected by many enviro㎚ent factors. They facilitate or impede growth of microorganism. If condition of external enviro㎚ent was not adequate, microorganism couldn't grow, even though there are much nutrient. Especially, such as temperature, moisture and pH, they have effect on growth of microorganism. Therefore we have to maintain external enviro㎚ent properly. In this experiment, we look into influences; temperature and pH, that affect growth of microorganism.
실험 기구 및 시약
1. 온도의 영향에 따른 생장
1) Luria bertani broth (LB broth), Marine broth, 15 ㎖ tube 8개, Micro pipette, 멸균 tip
2) 배양된 균 (E.coli, vibrio), 온도별 (15℃, 25℃, 37℃, 50℃) 배양기, 96 well plate, 96 well plate
3) ELISA reader
2. pH의 영향에 따른 생장
1) pH별 (pH 4-10) LB broth, 배양된 균 (E.coli), 15 ㎖ tube, 96 well plate, Micro pipette, 멸균 tip
실험 방법
1. 온도의 영향에 따른 생장
1) 먼저 각각 15℃, 25℃, 37℃, 50℃의 온도에서 배양시킬 4개의 15 ㎖ tube를 준비하고, 각각의 tube에 LB broth와 Marin broth를 4 ㎖씩 분주하였다.
2) 분주한 LB broth에 균 E.coli를, Marin broth엔 vibrio를 40 ㎕를 접종한 후 배지는 각각의 온도의 shacking incubator에서 16시간 동안 배양시켰다.
3) 16시간 후, 배양액을 96 well plate에 분주한 후 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
2. pH의 영향에 따른 생장
1) 7개의 15 ㎖ tube에 pH 별 LB broth를 4 ㎖씩 분주하고, 분주한 배지에 균 (E.coli) 50 ㎕를 접종하였다.
2) 그 다음, shaking incubator에서 37℃로 16시간 배양시킨 후, 배양액을 96 well plate에 분주하여 600 ㎚에서 흡광도를 측정했다.
실험 결과 및 토의
1. 실험 고찰
Fig. 1은 준비된 각각의 배지에 균 (E.coli)을 접종하고 있는 과정이다. Fig. 2는 pH 조성에 따른 미생물 측정을 위해 pH 미터기를 이용하여 pH를 조절하는 과정이다. Fig. 3은 well plate에 각각의 배양액을 리더기를 이용해 흡광도를 측정하는 사진으로, 모니터에 흡광도 값이 출력된다.
Table 1은 E.coli와 vibrio 세균을 이용하여 온도에 따른 미생물의 증식을 알아보고 비교하기 위한 흡광도 값이다. 각 온도마다 3개의 Sample을 준비하여 측정한 후 평균값을 냈다. 그 결과, 우리조가 실험한 E.coli의 흡광도 값은 15℃에서 0.139, 25℃에서 0.056, 37℃에서 1.252, 50℃에서 1.159을 나타내었다. 또한 vibrio는 15℃에서 0.938, 25℃에서 0.883, 37℃에서 0.293, 50℃에서 0.823의 흡광도 값을 나타내었다.
Fig. 4는 Table 1의 값을 그래프로 나타낸 그림이다. 그림의 그래프를 살펴보면 E.coli는 35-40℃ 사이에서 높은 흡광도 값을 나타낸 것으로 보아 해당 온도에서 가장 잘 증식하는 것으로 나타났으며, vibrio는 25-37℃ 사이에서 증식이 감소하는 것을 볼 수 있다.
일반적인 세균 생장의 최적 온도는 37℃ 부근이다. E.coli는 보통 배지에서도 잘 발육하고 발육 가능한 온도는 7-48℃, 최적온도는 35-37℃이다. E.coli의 실험 결과, 37℃의 부근에서 가장 큰 생장이 이루어 졌음을 보아, 실험의 결과가 잘 나왔다고 볼 수 있다. 또한 vibrio는 본래 16-42℃의 범위에서 생장이 가능하며 최적온도는 37℃이다. 그러나 실험 결과를 보면, 37℃에서 거의 증식이 이루어지지 않음을 볼 수 있다. 이러한 결과는 접종이 잘못되었거나, 증식조건이 좋지 않아 증식이 잘 이루어지지 않아 생긴 현상으로 보인다.
Table 2는 pH 4-10의 각 pH 별로 총 7개의 LB broth를 만들어 균 (E.coli)을 접종하여 37 ℃에서 배양한 결과를 나타낸 표이다. pH 4-10 의 흡광도 값은 차례로 0.057, 1.169, 1.175, 1.178, 1.227, 1.0106, 0.0534이다. 측정한 흡광도 값을 통하여 미생물의 발육 정도를 알 수 있었다. pH 4와 pH 10에서는 미생물이 거의 자라지 않은 것을 볼 수 있고, pH 6-8 사이에서 가장 증식이 활발한 것으로 측정 되었다. 일반적으로 대부분의 세균은 중성부근에서 약알칼리성 즉, pH 7-7.5에서 가장 잘 발육한다(1). 본 실험에서와 같이 중성부근의 흡광도 값이 크게 나온 것으로 보아, 미생물이 생육하기에 알맞은 pH 환경을 확인 할 수 있었다.
Fig. 5는 Table 2의 값을 토대로 나타낸 그래프이다. 이 그래프는 미생물의 증식정도를 보여준다. 앞서 언급한바와 같이 일반적 세균 생장의 최적 pH는 중성부근이다. 본 실험에 사용된 E.coli의 발육 가능한 pH 범위는 4.5-9.0이다. pH 5-9 부근의 흡광도 값이 큰 것으로 보아 실험의 결과가 알맞게 나왔다. 하지만 본래 중성부근에서 가장 높은 흡광도 값이 나와야 하지만, 오히려 pH 9 부근에서 더 높은 값이 측정 되었다. 이것은 실험 도중 pH 조절이 제대로 되지 않았을 가능성이 있었던 것으로 보인다. 이와 같이 미생물 주변의 환경요인은 미생물의 생육을 촉진하기도 하고 저해하기도 한다. 이러한 환경요인을 아는 것은 식품을 연구, 보존하고 미생물산업을 이해하는 데에 있어 매우 중요하며 필수적인 지식이라고 생각한다.
정리하면, 미생물의 생육은 여러 가지 환경요인에 의해 영향을 받기 때문에 외부 환경조건이 적절하게 유지되어야 미생물이 잘 자랄 수 있다. 우리는 인위적으로 미생물을 죽게 하거나 번식을 억제함으로써 미생물의 생육을 조절하여 식품의 저장기간을 늘리거나 식품의 부패를 방지할 수 있다. 본 실험을 통해 외부적 환경의 조작을 통해 세균 증식에 영향을 미치는 온도와 pH 조건을 알아보고, 이러한 지식을 식품과 어떻게 관련시키며, 적용시킬 것인지 생각해 보는 데에 그 목적이 있다.
댓글