생화학실험 | 아미노산의 정성분석과 단백질의 정량 분석

 

 

 

아미노산 (Amino acid)

단백질을 염산과 함께 가열하면 여러 가지 아미노산의 혼합물질이 얻어진다. 이러한 아미노산의 혼합물에서 각각의 아미노산을 분리하는 방법은 Emil Fischer에 의해서 개발되었고, 현재는 최소한 25종이 분리되었다. 결국 단백질은 이러한 아미노산으로 구성되어 있다.

 

아미노산은 화학적으로 정확하게 표현한다면 아미노알칸산(amino alkanoic acid)이며, 분자구조에 아미노기(-NH2)와 카르복실기(-COOH)를 갖고 있으며, 카르복실기에 대해서 α위치에 아미노기가 결합된 것을 α아미노산(α-amino acid), β위치인 경우는 β아미노산(β-amino acid), γ위치의 경우는 γ아미노산(γ-amino acid)라고 한다. 한편, 단백질을 가수분해하여 생성되는 아미노산은 대부분이 아미노기와 카르복시기와 같은 단소원자에 결합하여 R-CHNH2-COOH의 일반식으로 나타낼 수 있는 α아미노산들이다.

 

 

 

단백질 (Protein)

단백질은 생물세포 원형질의 주요 구성성분으로서 생명현상과 깊은 관계가 있으며, 인간이 필요로 하는 탄수화물, 지방과 함께 3대 영양소의 하나이다. 단백질은 탄소, 수소, 산소 이외에 질소와 황 등의 원소를 함유하고 있는 아주 복잡한 구조의 거대분자로서 분자량은 약 2만에서 2천만 정도에 달한다. 단백질은 몇 개에서 수 천 개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드이다. 단백질은 호소나 호르몬, 막공(membrane pore), 수용체, 세포 구조의 요소로서 생체 내에서 다양한 작용을 한다.

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실험 방법

1. 아미노산의 정성분석

1) Ninhydrin 시험

① 시료용액 1㎖를 각각의 시험관에 따로 담는다(시료용액 : 0.1% 수용액-글리신, 티로신, 트립토판, 프롤린 ), 1% 수용액-알부민, 젤라틴. 1% 암모니아수

② 0.2% Ninhydrin 수용액을 각 시험관에 5방울씩 떨어뜨린다.

③ ②번 시험관을 2분간 가열한다.

④ 색 변화를 관찰한다.

 

2) Xanthoprotein 시험

① 시료용액 0.5㎖를 각각의 시험관에 따로 담는다.(시료용액 : 0.1% 수용액-글리신, 티로신, 트립토판, 페닐알라닌) 1% 수용액-알부민, 젤라틴, 0.1% 수용액-페놀

② ①번 시험관에 진한 HNO₃를 0.5㎖씩 넣고 색변화를 관찰한다.

③ ②번 시험관을 관찰한 후 NaOH를 첨가한다.

④ 색 변화를 관찰한 후 ②번 색 변화와 비교해본다.

 

3) Millon 시험

① 시료용액 1㎖를 각각의 시험관에 따로 담는다. (시료용액 : 0.1% 수용액-글리신, 티로신, 페닐알라닌), 1% 수용액-알부민, 젤라틴, 0.1% 수용액-페놀

② Million 시약 5방울을 각 시험관에 넣고 물중탕 속에서 10분간 가열한다.

③ ②번 시험관을 상온까지 식힌 후, NaNO₂ 5방울을 더 첨가한다.

④ 색 변화를 관찰한다.

 

4) Hopkins-Cole 시험

① 시료용액 2㎖를 각각의 시험관에 따로 담는다. (시료용액 : 0.1% 수용액-글리신, 티로신, 트립토판), 1% 수용액-알부민, 젤라틴,

② 햇빛에 쬔 빙초산 2㎖씩 첨가한다.

③ 진한 황산 2㎖를 시험관 벽을 따라 넣어준다.

④ 두 액층 사이에 나타나는 색을 관찰한다.

 

5) Pauly 시험

① 술파닐산 1㎖를 각각의 시험관에 넣는다.

② ①번 시험관에 시료용액 2㎖를 각각 따로 첨가한다.(시료용액 : 0.1% 수용액-글리신, 티로신, 히스티닌, 트립토판), 1% 수용액-알부민

③ ②번 시험관에 NaCO₃ 1㎖를 첨가한 후, 얼음물 속에서 3분간 방치한다.

④ Na₂CO₃용액 2㎖를 더 첨가한 후 색 변화를 관찰한다.

 

6) Biuret 시험

① 시험관에 시료용액 2㎖을 넣는다. (시료용액 : 0.1% 수용액-글리신), 1% 수용액-알부민, 젤라틴, 0.3% 수용액-소의 혈청, 펩톤

② CuSO₄ 용액 5방울 가한 후, 40% NaOH 2㎖를 각각의 시험관에 넣는다.

③ 두 액층 사이의 색 변화를 관찰한다.

④ 다시 한번 시료용액을 준비하고, 준비된 Biuret 시약을 넣고, 색 변화를 관찰한다.

 

2. 단백질의 정량 분석

1) 알부민의 황산암모늄 침전

① 비커에 달걀 흰자만을 취하여 넣고 200㎖ 물을 넣는다.

② ①번 시험관을 원심분리기를 용하여 글로불린과 알부민을 분리를 한다.

③ 글로불린 침전을 가능한 한 소량의 1% NaCl 용액에 녹인다.

④ 같은 부피의 (NH₄)₂SO₄ 포화용액을 가하여 침전을 다시 분리한다.

⑤ 일부를 취하여 단백질의 확인 시험을 해본다.

⑥ 알부민 용액은 고체 (NH₄)₂SO₄가 포화될 때 까지 가한다.

⑦ 침전 확인 후, 단백질 정성 시험을 해본다.

 

2) 투석

① 투석용 셀로판튜브를 8～10㎝ 길이로 잘라 한쪽을 묶어 주머니로 만든다.

② 주머니에 글로불린 용액과 5% 글루코오스 용액을 각각 2㎖씩 넣고 주머니 다른 한쪽을 매어 50㎖의 물에서 저어준다.

③ 30분 후, 바깥쪽 물을 취하여 Benedict 시험과 Biuret 시험을 한다.

④ 바깥쪽 물 1㎖을 취하여 0.5% HNO₃를 한 방울 가한 후 AgNO₃ 용액을 3방울 떨 어뜨려본다.

⑤ 한 시간 후 똑같은 실험을 한다.

 

3) 단백질의 변성 실험

① 각각의 시험관에 알부민, 젤라틴, 펩톤을 3㎖씩 넣는다.

② ①번 시험관에 1N HCl, 1N NaOH, H₂O를 첨가한 후, 침전을 확인한다.

③ ②번의 시험관을 10분간 중탕한 후, 상온에서 식혀준다.

④ 산 or 알칼리로 중화한 후 색 변화를 관찰한다.

 

4) 중금속에 의한 침전

① 2㎖ 단백질 용액에 몇 방울의 중금속염 용액을 가하여 침전이 생기는 것을 관찰한다.

② 관찰 후, 과량의 중금속염을 첨가시켜 색 변화를 관찰한다.

 

 

 

[세포생물학실험]아미노산과 단백질의 정성, 정량 분석

 

 

 

[생화학실험]아미노산의 정성분석과 단백질의 정량 분석 레포트