일반생물학실험 | Immunohistochemistry와 위 양성반응 경로 차단

 

 

 

TIP

 

 

1. 항체반응을 이용하여 신경세포를 염색해본다.
2. 실험을 준비하는 과정에서 위 양성반응의 경로를 생각하고 차단하는 설계를 배운다.

 

 

 

본 실험은 표적세포에서만 발견되는 단백질에 1차 항체를 붙이고, 그 1차 항체에 2차 항체를 붙인 후, 2차 항체에 붙어있는 peroxidase에 의해 DAB가 H₂O₂와 반응하여 갈색으로 염색되는 실험이다. 이렇게 실험이 진행되는 과정에서 두 가지 위 양성경로를 생각할 수 있다.(false positive reaction : 양성이 아님에도 나타남)

 

1. 세포 내에 있는 과산화소체에 의해 표적세포가 아닌 다른 세포까지 염색이 되는 경우.

2. 세포 표면에 있는 Fc 수용체가 2차 항체의 Fc부분과 맞아떨어져 다른 세포가 염색이 되는 경우.

 

이런 두 가지 경로를 막기 위해 이번 실험에서는 ①Quenching 과 ②Block이라는 과정을 거친다.

① Quenching(담그는 과정) : 본 실험에서는 hydrogen peroxide 0.3%용액에 약 15분간 담가 세포 내의 과산화소체가 제 역할을 못하게 만든다.

② Block : 2차 항체의 Fc부분을 수용하는 부분을 포화시켜, 나중에 2차 항체가 다른 곳에 들어갈 경로를 막는다.

 

 

항체(antibody, Ab)

항원과 결합하는 단백질을 말하며, 혈액과 체액에 녹아있는 immunoglobulin(Ig)을 일컫는 말이다. 항혈청을 전기영동 하여 보면, 항체는 가장 음극 쪽, 즉 albumin, α-globulin, β-globulin 보다 더 음극 쪽에 모여서 나타납니다. 그 결과, 항체를 다른 말로 γ-globulin이라고 부르게 된 것이며, 다른 말로 면역반응에 관여하는 글로부린이라 하여 immunoglobulin (Ig)이라고도 부르는 것입니다. 항체는 전하 (charge), 크기 (size), 용해도 (solubility)등과 같은 물리화학적 성질이 매우 유사하며, 종류는 5가지 인데 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE로 나뉘며, G와 A급에 속하는 항체들은 더 작은 단위로 아형이 존재 합니다.

 

불변부위 (constant region)

 

가변부위 (variable region) : 가변부위의 일부인 상보성 결합부위(complementarity determining region)

 

Disulfide bond (SS결합) : 단백질 등에 있는 SH기가 산화되어 생기는 결합 (시스테인). 입체구조 유지, 분자의 안정화에 도움이 되며, 상대적으로 잘 변성이 되지 않는다.

 

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실험 방법

1. 실험 1 일차

1) 조직을 30㎛로 cryocut한 후, PBS용액에 5분간 씻는다.

 

2) 과산화수소를 0.3%로 하여 조직을 15분간 Quenching.

 

3) PBS에 5분씩, 3번 씻는다.

 

4) Normal goat serum 5%용액에 1시간동안 담가둔다. (Block)

 

5) 1차 항체 수용액을 준비한다. 300㎕

 

6) 1차 항체 수용액에 조직을 담구고 4℃를 유지하여 하루 동안 둔다.

 

2. 실험 2 일차

1) 조직을 PBS 용액에 5분간 3번 씻는다.

 

2) 2차 항체 수용액을 준비한다.

 

3) 1:500의 비율로 PBS에 희석시켰으므로 2㎖를 기준으로 한다면, PBS 1.9㎖ + Secondary Antibody 1㎖

 

4) 조직을 2차 항체 수용액에 1시간 30분간 담가둔다.

 

5) PBS용액에 5분간 5번 씻는다.

 

6) DAB와 H₂O₂를 함께 넣어 2분 동안 둔다.

 

7) mount 후 관찰

 

 

[일반생물학실험] Immunohistochemistry와 위 양성반응 경로 차단 레포트