물리학실험 | FRET을 이용한 DNA 상호작용

 

 

 

FRET은 두 종류의 형광물질이 가까운 거리에 있을 때 공명에 의해 에너지를 전달하는 현상을 말한다. FRET의 원리는 에너지를 전달하는 donor가 들뜬 상태에서 바닥상태로 내려오면서 광자를 내놓을 때, 두 형광분자가 가까운 거리에 있다면 acceptor가 이를 받아들여서 파장이 다른 빛을 내놓게 된다는 것이다. 이번 실험을 통해 FRET 현상에 대해 알아보았다.

 

Donor에 Acceptor를 많이 넣을수록 FRET 효율이 높아진다. 하지만 Acceptor의 양이 Donor의 양보다 많아지는 순간부터는 Donor와 Acceptor의 상보적 결합이 포화된(모두 이뤄짐) 상태이므로 FRET 효율의 증가가 더디다.

 

 

FRET

FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)은 두 종류의 형광물질이 가까운 거리에 있을 때 공명에 의해 에너지를 전달하는 현상을 말한다. 에너지를 전달하는 donor가 들뜬 상태에서 바닥상태로 내려오면서 광자를 내놓을 때, 두 형광분자가 가까운 거리에 있다면 acceptor가 이를 받아들여서 파장이 다른 빛을 내놓게 된다. FRET으로 나오는 빛의 세기는 두 분자의 거리에 관계되므로, FRET를 이용하면 두 형광물질 사이의 거리를 알아낼 수 있다. FRET이 일어나는 거리는 10Å～100Å으로 단백질의 크기나 세포막 두께 정도에 해당하는 거리이므로 생물 분야 연구에 널리 쓰이고 있다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) Multimode detector의 전원을 켠다. 컴퓨터의 전원을 켜고 바탕화면에 있는 [Multimode Analysis Software]를 실행한다.

 

 Sample loading on Microplate

 

2) 샘플을 준비한다. 약 900㎚의 DNA in TE buffer(NaCl 172mM for Donor, 190mM for Acceptor) solution이다.

 

3) 그림에 맞는 위치에 샘플을 loading한다.([A1, A2]에는 Donor만 50㎕씩, [A4, A5]에는 Donor 50㎕ + Acceptor 25㎕ 씩, [A7, A8]에는 Donor 50㎕ + Acceptor 50㎕ 씩, [A10, A11]에는 Donor 50㎕ + Acceptor 100㎕ 씩 넣는다. 이 때 Donor를 6번 넣고, 피펫 tip을 바꾼 다음에 Acceptor를 넣는 것이 효율적이다.)

 

4) 왼쪽 tab에서 가장 위의 [protocols]을 클릭한다. 오른쪽 큰 화면에 목록이 뜨는데 여기서 [test]라고 적힌 것이 우리가 사용할 protocol을 만들어 놓은 것이다. [test]를 선택하고 왼쪽 위의 [Run]을 클릭한다.

 

5) 왼쪽에서 [Eject]를 클릭하면 Multimode detector의 microplate carrier가 나온다. 가운데 화면에 나오는 plate의 방향을 잘 보면서 plate를 얹는다.(이때 잘 모르겠으면 조교에게 문의한다.) [Load]를 클릭해서 carrier를 닫는다. 이제 화면 아래의 [Run]을 실행하면 detector가 주어진 protocol 대로 작동한다.

 

6) 위와 같이 섞어주고 기다리는 과정을 거치면서 총 4번의 측정을 한다.

 

7) 실행이 끝나면, Software에 데이터가 표시되고 Excel창이 5개가 생긴다. Excel의 데이터를 가져가서 분석하도록 한다. 각각의 데이터는 measurement 1과 measurement 2 두 번의 측정값을 가지기 때문에 [A1, A2]처럼 두 개의 샘플에서 총 4개씩의 값이 나온다.

 

8) 평균값을 이용해서 각 샘플별 비교 및 분석, 시간에 따른 변화의 유무 등을 체크한다.

 

9) Microplate를 꺼내고 샘플을 밖으로 흘리지 않도록 조심하면서, 지정된 위치에 버린다.

 

10) 기기와 컴퓨터는 그대로 두고, 주변을 정리한다.

 

 

 

[물리학실험]FRET을 이용한 DNA 상호작용 레포트