일반생물학실험 | 대장균 DNA의 추출과 정량

 

 

 

본 실험은 대장균(Escherichia coli)의 DNA(deoxyribonucleic acid)를 추출하고, 겔 전 기영동법(gel electrophoresis)으로 DNA의 추출 여부를 알아보고자 하는 실험이었다. 먼저 Escherichia coli 배양액에서 Escherichia coli를 원심분리하여 얻었다. supernatant를 제거 한 후, Escherichia coli를 EDTA, SDS, NaOH 용액 등으로 세포벽과 단백질 등을 파괴한 다.

 

그 후 NaCl과 etahnol을 넣어 DNA를 농축시켜 얻는다. 이렇게 얻은 DNA를 RT에서 hydration 시킨 후 gel electrophoresis를 이용해 DNA의 상대적 질량, 양 등을 알아보았다. 그리고 gel electrophoresis가 끝나면 EtBR 용액으로 DNA를 염색한 후, UV lamp 하 에서 DNA의 추출 여부를 확인해 보았다.

 

UV lamp 하에서 찍은 사진에서는 DNA와 RNA를 볼 수 있었다. 위쪽에는 DNA가 두 줄 로 관찰되었고, 맨 아래쪽에는 RNA들이 많이 있는 것을 볼 수 있었다. 뒷조의 DNA에는 pEX18T라는 플라스미드(plasmid)를 끼워놓았는데, 이것은 chromosomal DNA보다 크기가 작기 때문에 chromosomal DNA보다 더 아래에 나타났다. 이 사진으로 Escherichia coli의 chromosomal DNA, plasmid, RNA 등의 상대적인 크기는 알 수 있었지만, size marker가 없었기 때문에 정확한 size는 알 수 없었다.

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실험 방법

1. DNA isolation

1) 먼저 e-tube에 E. coli 배양액을 1.5㎖ 넣고 12000rpm에서 1분간 원심분리 한다. 이때 주의할 점은 balance를 맞춰서 e-tube를 넣어야 한다는 점이다.

 

2) 원심분리 한 후 pipette로 supernatant를 완전히 제거 한 후 pellet에 1㎖ 0.01M EDTA를 넣고 vortexing하여 30㎖ beaker로 옮긴다.

 

3) 그리고 beaker에 10% SDS 용액 150㎕과 1N NaOH 용액 50㎕를 넣고 beaker를 흔들어 용액이 맑아지는 것을 확인한다.

 

4) 그 후 2M NaCl 100㎕, 95% EtOH 2㎖를 넣은 후 유리막대를 저어주며 침전된 DNA를 감아준다.

 

5) 유리막대에 감긴 DNA를 공기중에서 20분 정도 말리고, 1㎖의 DIW가 담긴 e-tube에 녹이고 RT에서 20분간 hydration 시킨다.

 

6) 그리고 DNA에 전 기영동용 loading buffer를 첨가하고 잘 섞은 후 gel의 홈에 조심스럽게 넣는다.

 

7) gel box의 뚜껑을 닫고 120V에서 40분간 전압을 가한 후, EtBR 용액에 gel을 10분간 담궈 염색한다. 그 후 gel을 UV lamp 하에서 관찰해 추출된 DNA를 확인한다.

 

 

 

[일반생물학실험] 대장균 DNA의 추출과 정량 레포트