미생물실험 | 항생제 감수성 - Antibiotic Susceptibility Testing

 

 

 

TIP

 

 

1. 항생제를 이용하여 원판 확산법 실험을 해봄으로써 특정 세균에 대한 항생제 감수성을 이해한다.
2. 임상 실험에서는 환자의 검체로부터 질병의 원인균을 검출하여 세균 동정과 동시에 항균제 감수성 검사를 하여 감염증 치료에 필요한 항생제를 선택하기도 한다.

 

 

 

항생제 감수성 시험

병원 미생물의 항생물질 감수성을 조사하거나, 미생물에 대한 항생물질 의 역가, 순도, 또는 함량을 측정하는 방법으로써, 미생물을 이용한 생물학적 검정법인 확산법이 널리 이용되고 있다. 또한, 액체배지 희석법과 같은 원리를 이용한 탁도법도 있는데, 이는 액체배지 중에 포함되어 있는 항생물질의 양에 따라 성장의 억제 정도가 달라지고, 그에 따라 나타나는 배양액의 탁도의 차이가 나타남에 따라, 이를 비교하여 항생물질의 역가를 계산하는 방법이다.

 

1. 디스크 확산법

① 일정량의 항생물질이 함유된 종이 디스크를 균체를 도말한 고체 배지 위 에 놓으면 항생물질이 확산되어 나가면서, 검체균이 감수성인 경우 성장 저지환이 생긴다. 생성된 저지환의 크기로 그 균이 디스크 속의 항생물 질에 어느 정도 감수성인가 또는 내성인가를 알 수 있다.

 

 

② 조작이 간단하며 결과 판단도 신뢰성이 있기 때문에 병원에서 감염 환자 로부터 분리한 균이 어떤 항생물질에 감수성인가 내성인가를 알고자 할 때 널리 이용하고 있다.

③ 디스크 확산법에는 일정 농도의 항생물질에 의해 생성되는 성장 저지환 의 크기에 따라 감수성 여부를 판단하는 1단계 농도 디스크법 (Kirby-Bauer Method)과, 3가지 다른 항생물질 농도 디스크를 사용하여 성장 저지환이 생성되는 유무를 통해 감수성 여부를 판단하는 3단계 농도 디스크법이 있다.

 

2. 항생제 최소억제농도 측정법

① 특정 미생물 균주의 성장을 억제할 수 있는 항생물질의 최소억제농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하는 방법에는 액체배 지 희석법과 고체배지 희석법이 있다.

② 액체배지 희석법: 미생물 배양에 사용하는 액체 배지로 항생물질을 2배 씩 희석한 후, 여기에 희석한 미생물 균액을 넣고 배 양시켜 균이 성장하지 않는 항생물질의 최소 농도를 성장 최소억제농도로 한다.

 

3. E-Test

특정 균에 대한 감수성과 최소억제농도 두 가지 모두를 알 수 있다. 5×50 mm 플라스틱 스트립에 단계별로 희석한 항균제를 함유시켜 MIC를 측정할 수 있다. (MIC는 inhibition zone 의 끝부분의 숫자를 읽어주면 된다.)

 

 

 

항생제의 종류

1. Penicilline계 (페니실린)

① 세균의 세포벽의 합성을 방지하여 삼투압의 차이로 세균의 세포벽이 파열되어 살균된다.

② 일반적으로 거의 모든 그람 양성균 및 간균에 대해 항균력이 있으며, 일부의 그람음성균에 대해 항균력을 나타낸다.

③ 연쇄상구균, 인플루엔자균, 장티푸스균에 작용

 

2. Cephalosporin계 (세팔로스포린)

① 항균력이 강하고 체내조직침투 우수

② 페니실린에 저항성이 생긴 포도상구균 등의 그람음성균뿐 아니라 proteus, serratia, enterobacter 등에도 효과가 있다.

 

3. Aminoglycoside계 (아미노글리코사이드)

① 세균의 단백 합성에서 기능성이 없는 단백질을 합성하도록 유도하여 항산성균, 포도상구균, 그람음성균에 대하여 살균작용을 나타낸다.

② 특히, 그람음성장내세균에 의한 질병 중 특히 균혈증, 패혈증, 심내막염 등에 가장 널리 쓰이는 살균성 항생제.

③ 그러나, 부작용(신독성,이독성,중추신경계)이 많아 대체물질 (페니실린) 등장

 

4. Tetracycline계 (테트라사이클린) : 광범위 항생제(broad spectrum)

① 미생물의 리보솜에서 t-RNA의 전사를 방해하여 단백질을 억제함으로써 항균 작용을 나타내나 고농도에서는 살균작용을 나타냄.

② Tetracycline는 광범위한 항생물질로서 많은 그람양성균, 그람음성균, 혐기성균에 대해 감수성을 나타내는 정균성 항생제.

 

5. Macrolide계 (마크로라이드)

① 분자내에 lactone 환을 갖고 있는 항생물질

② Erythromycin(주로 세균성 화농성 피부염의 치료에 사용), Spiramycin, Tylosin

③ 탄저균, 돼지유산균, 연쇄상구균속세균 등에 작용.

 

6. Chloramphenicol 계 (클로람페니콜)

① Streptomyces venezuelae 의 대사산물 중 하나로 산출되었으나 화학적으로 합성 가능

② 혐기성균을 포함한 대부분의 그람양성균, 그람음성균에 대해 효과가 있으며, 단백질 합성을 억제

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 배양된 균액을 연속 희석 후에 배지에 취한다.

 

 

2) 준비된 NA배지에 두 가지 농도(1/10⁴, 1/10⁵)의 세 종류의 세균(E.coli, S.aureus, C.albicans)을 도말한다. 도말할 때는 멸균된 면봉을 가지고 빈틈이 없이 여러 방향으로 촘촘히 균액을 퍼트려준다. 혹은, spreader를 이용하여 spreading(도말) 한다.

 

 

3) 페트리디쉬의 뚜껑을 덮고 3～5분간 방치하여 표면의 습기가 흡수되도록 한다.

 

4) 균액을 도말한 NA배지에 가느다란 멸균 핀셋을 이용하여 필요한 항생제 디스크를 미리 표시한 순서에 따라 배지 표면에 내려놓는다. 각 디스크간의 간격은 24㎜ 이상, 가장자리로부터는 15㎜ 떨어져야 한다. 가운데를 가볍게 눌러 한천배지 표면에 완전히 부착시킨다(뒤집어도 떨어지지 않아야 한다).

 

 

5) 디스크 위에 각각의 항생제 2㎕ 를 떨어뜨린다.

 

 

6) 디스크를 놓은 페트리디쉬는 37℃에서 16～18시간 배양한다.

 

7) 액체상태로 된 항생제인 fluconazole은 가운데에 puncher로 well을 뚫어 80㎕를 피펫으로 넣는다.

 

8) 페트리디쉬를 뒤집어 배양한다. 24시간, 48시간 후에 성장저지환의 지름(㎜)을 잰다.

 

 

 

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