생명공학실험 | 입자추적기법을 이용한 세포역학

 

 

 

TIP

 

 

1. 디지털현미경을 활용한 운동 분석 기법 습득 
2. 단세포의 운동을 공학적으로 분석

 

 

 

세포이동중의 세포돌출

1. 세포돌출중의 액틴 중합

선단부의 돌출은 액틴과 관련된 단백질(A게2/3화합물)과 액틴 절단 단백질(ADF, cofilin, gelsolin)에 의해 조절되는 액틴중합에 의해 주로 구동된다. Arp 2/3 화합물은 이동하는 세포 선단부에 집중되어 수지상 핵형성과 액틴 섬유의 분기를 유발한다. 액틴에의 cofilin 결합은 기존의 액틴 섬유를 절단하고, 액틴-cofilin 결합의 분리와 serine-3 에서의 cofilin 인산화는 액틴증합을 증진시킨다. 또 다른 액틴 절단 단백질의 gelsolin 역시 섬유하세포의 이동에 필요하다. Gelsolin을 제거하면 F-actin 함량을 증가시키고, filopodia 형성에 영향을 주지 않으면서 막의 파상 이동을 감소시킨다. 또한, 액틴 결합 단백질은 돌기의 모양을 lamellipodium 이나 filopodium 과 같은 형태로 조절할 수 있다.

 

2. 액틴형성에서의 Rho GTPases의 역할

Cdc42 와 Rac는 N-WASP, SCAR1, WAVE를 포함하는, Wiskott-Aldrich 증상 단백질(WASP)을 통하여 Arp 2/3을 조절한다. Arp 2/3 화합물의 증가와 이에 따른 액틴 증합과 세포 선단부에서의 분기는 Rac에 의한 SCAR1 및 WAVE의 활성화와 Cdc42에 의한 N-WASP의 활성화에 연이어 나타날 수 있다. Cdc42 와 Rac는 LIM-kinase 1 (LIMK1)과 LIMK2를 활성화 시켜 액틴 분리를 방해는 cofilin 인산화를 증가시킬 수 있다. 또한 Rac의 활성화는 액틴으로부터 gelsolin 분리를 유발시켜 액틴 중합을 조장할 수도 있다.

 

Rho는 downstream effector 인 mDia 단백질과 p160ROCK(Rho-kinase)를 통해 액틴 결합과 FA 형성을 촉진시킨다. mDia 단백질은 액틴 증합을 유도하고, p160ROCK는 스트레스섬유 및 FA의 형성과 액토미오신 수축을 조절한다. Rho family GTPases의 활동은 구아닌 뉴클레오티드 교환요소(GEFs),GTPases-활성 단백질(GAPs), 그리고 구아닌 뉴클레오티드 분리 억제제(GDIs)에 의해 조절될 수 잇다. GEFs는 GTPases를 활성화 시키기 위해 GDP와 GTP의 교환을 촉진시킨다. GAPs는 GTP가수 분해를 조장함으로써 GTPase의 활동을 감소시키고, GDIs는 GTPase 의 GDP 결합 형태를 격리시킴 으로써 GTPase의 활동도를 저해시킨다. 액틴 증합의 조절은 국소부착 키나아제(FAK)와 Src family 키나아제가 타이로신 인산화를 통해 N-WASP의 활동과 세포내 국부 집중을 집중하는 것과 같이 Rho GTPases 이외에도 많은 다른 경로에 의해서 수행될 수 있다.

 

3. 미세소관과 액틴섬유와의 교신

미세소관 역시 액틴 및 Rho GTPases 와의 상호작용을 통해 선단부의 돌출에 중요한 역학을 수행한다. 액틴과 미세소관은 되먹임작용을 일으키는 상호영향력을 끼친다. 액틴 섬유의 신장은 극성화된 미세소관의 불안정성을 촉진시키고, 미세소관은 특정 Rho family GTPases을 통하여 세포 이동 방향을 제어하도록 액틴 세포 골격을 조절할 수 있다.

 

 

세포 돌출력

1. 돌출력 생성

돌출력 생성은 화확적 신호가 기계적 에너지를 생산하는 과정이다. 이 과정은 액틴 중합과 미세소관 확장, 그리고 세포내 유체의 이동이 관련되어 있다. 돌출력의 핵심인 액틴 중합은 기본적으로 턱있는 끝쪽엔 서브유닛이 첨가되고 뾰족한 끝쪽 서브유닛은 감소되는 단순한 작용의 반복이다. 액틴 중합은 액틴 서브유닛의 재활용을 유지시키는 ATP 가수분해와 결부되어 있다. ATP-액틴이 턱있는 끝쪽에 결합한 결과 액틴 신장이 일어나고, ATP가수 분해에 의해 ATP-액틴이 뾰족한 끝쪽에서 분리된다. 액틴 서브유닛이 턱잇는 끝쪽에 첨가되면서 막에 의해 섬유가 뒤쪽으로 구부러지고, 이에 따른 복원력이 섬유를 막 반대쪽으로 밀면서 돌출역이 생성된다.

 

2. 돌출력 측정

레이져 optical tweezer를 이용하여 세포막 돌기의 신장에 필요한 힘을 측정할 수 있다. IgG가 입혀진 구슬로 사상족 모양의 사슬을 끌어당김으로써, 신경성장 원추세포의 신장에 필요한 힘을 측정한 사례가 있다. 사슬을 정지상태로 유지하기 위해 필요한 힘은 액틴 세포골격의 파괴와 함게 감소하였으며, 사슬의 신장속도의 증가에 비례하여 구슬에 가해지는 사슬의 힘도 증가하였다. 살아있는 세포의 복잡함 때문에 돌출과 관련된 활동의 연구는 일반적으로 단순화되어 재구성된 시스템을 이용하여 이루어진다.

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실험 방법

1. 디지털 현미경 사용법

1) 디지털 현미경의 USB를 컴퓨터 연결하고 프로그램을 실행한다.

 

2) 보고자 하는 물체를 준비하고 알맞은 확대 배율을 조정한다.

 

3) 물체와 현미경 렌즈 사의 간격을 조절하며 초점을 맞춘다. 빛이 부족할 경우 보조 광원을 이용한다.

 

4) 필요에 따라 현미경 거치대에서 현미경 몸체를 분리하여 사용한다.

 

5) 컴퓨터 프로그램을 이용하여 사진, 동영상 촬영을 하고 데이터를 저장한다.

 

2. 폴리머 입자 분석 방법

 

 

 

 

[생명공학실험]입자추적기법을 이용한 세포역학 레포트