일반생물학실험 | PCR & Molecular Cloning

 

 

 

PCR

1. Primer design 원리

목표로 하는 DNA 시퀀스의 시작과 끝부분에 상보적으로 결합해서 DNA 중합효소가 DNA 중합을 시작할 수 있도록 '시발체' 역할을 해주는 짧은 다염기체이다. DNA 복제에 primer가 필요한 이유는 과정을 촉매하는 효소인 DNA중합효소가 이미 존재하는 유전자 가닥에 새로운 nucleotide를 붙이는 역할만 할 수 있기 때문이다. DNA중합효소는 primer의 3'end에서 시작하여 반대편 가락을 복제한다.

 

목표 시퀀스에 상보적인 아무 염기서열이나 마구잡이로 정해서 primer를 만드는 게 아니라 이 primer의 염기 구성이 어떠냐에 따라서 PCR의 효율이 큰 영향을 받기 때문에 최적의 primer를 만들기 위해서는 갖춰야 할 조건들이 있다. 먼저 길이는 20～30bp 정도여야 한다.

 

primer에 따라서 Annealing 온도가 변화하기 때문에 G, C의 양을 고려하여 G+C%가 50～60%로 구성하고 purine과 pyrimidine 염기의 연속적인 배열을 피해야 하며, 한 쌍의 primer가 부분적으로 서로 상보적이지 말아야 한다. 그리고 primer의 3‘말단에 G나 C가 3개 이상 연속적으로 오지 않도록 하여 hair pin loop 형성을 피해야 한다. 마지막으로 Tm값이 60～70℃ 여야 하고 Tm값이 동일한 두 primer를 설계해야한다.

 

1. 결과에 target size 외에 다른 band가 보인다면 개선해야 할 방향은?

primer가 붙어야 할 곳에만 붙지 않고 여기저기 붙었기 때문이다. 그러므로 Tm 값을 높여주면 개선될 것이다.

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Molecular Cloning

1. restriction enzyme cutting 후 purification을 해야 하는 이유?

Restriction enzyme을 이용해서 cutting을 하면 plasmid가 2개로 나누어지는데 우리가 필요한 부분이 아닌 나머지 부분이 계속해서 남아있다면 불필요한 조각의 말단에 insert가 붙을 수 있는 환경이 되고 그만큼 필요한 부분에 insert가 결합할 확률이 낮아지게 된다. 그러므로 필요한 부분에 insert가 결합할 확률을 높이기 위해서 purification을 해야 한다.

 

2. Colony가 하나도 생기지 않았다면 개선해야 할 방향은?

Colony가 하나도 생기지 않았다는 것은 cell이 plate에서 살아남지 못하고 모두 죽었기 때문이다. ligation, transformation, picking 과정에서 오류가 생겼다고 볼 수 있는데, 먼저 competent cell의 오염이나 plate의 오염 때문에 transformation이 실패할 수가 있다. 또 heat shock을 주는 과정에서 너무 오래 heat shock을 주어서 cell이 파괴될 수도 있기 때문에 조심해야 하고 효율을 높이기 위해 competent cell과 plasmid를 섞은 다음 좀 오래 아이스박스에 놔두는 것이 좋다. 그리고 cell을 plate에 spreading할 때 roller를 소독을 위해 너무 뜨겁게 하여 사용하거나 세게 spreading하여 cell이 파괴되는 것이 아닌지 확인해보아야 한다. 아니면 대장균이 배양될 시간을 주기 위해 LB배지를 37도로 유지하며 좀 더 오래 키워본다.

 

 

 

[일반생물학실험] PCR & Molecular Cloning 레포트