일반생물학실험 | Mini preparation

 

 

 

TIP

 

 

DNA의 크기차이에 의해 분리하는 방법인 alkaline lysis method를 이용하여 정제된 DNA의 양을 불린다.

 

 

 

유전자 재조합은 DNA를 목적에 따라 적절히 자르고 붙여서 유전물질을 원하는 형태로 개조시키는 과정이다. 가장 기본적인 DNA조작기법인 재조합DNA(recombination DNA) 기술은 필요로 하는 외부 DNA단편을 vector라고 부르는 운반자 plasmid DNA분자에 연결시켜 목적으로 하는 DNA부분만 증폭시킬 수 있는 새로운 재조합 DNA를 만드는 것이다. 즉, 제한효소를 사용하여 목적 DNA와 plasmid DNA를 잘라 이 두 분자를 ligase를 사용하여 연결시키는 것이다.

 

이렇게 반응시킨 DNA용액을 대장균에 형질전환 시킨다. 이 때 원하는 DNA분자가 만들어졌는지를 조사하기 위하여 형질전환체 중 여러 colony를 후보로서 택하여 형질전환체 내에 들어있는 plasmid DNA를 조사하여야한다. 이 때 plasmid DNA분리에 사용되는 preparation(of plasmid DNA) 방법은 많은 후보를 빠른 시간에 분석하는데 유용하게 사용되어진다. 주로 minipreparation(mini prep.)이라고 부르는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다.

 

여러 가지 방법이 있지만 가장 보편적으로 쓰이는 방법이 Alkaline lysis method이다. 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA만을 분리하는 것이다. 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하여 구분하여 분리하기가 쉽지 않다.

 

단, chromosomal DNA는 분리과정에서 linear형태가 되고 크기가 커서 대부분 침전의 형태로 제거될 수 있어 이 방법으로도 100ng-5ug의 plasmid DNA를 얻을 수 있다. 이 방법으로 추출한 DNA는 소량이나 enzyme처리나 size확인, sequencing, transfection 등의 실험이 가능하며 2시간 이내에 30samples 이상의 DNA 분리가 가능하다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 1㎖의 배양액에 single colony를 따서 접종하여 37℃에서 overnight 배양한다.(이미 배양되어져서 굳이 우리가 할 필요는 없었다. 셀입자 때문에 불투명한 액체)

 

2) 그 배양액을 microfuge tube로 옮긴다.

 

3) 원심분리(12,000rpm for 30sec)하여 상층액을 버리고 침전물만을 모은다.

 

4) 100㎕의 차가운 solutionⅠ을 배양된 세포가 들어있는 tube에 넣고 vortex하여 침전물을 완전히 현탁한다.

 

5) 200㎕의 신선한 solutionⅡ를 넣고, tube를 조심스럽게 대여섯 번 정도 위 아래로 위치를 바꾸면서 섞어주고 얼음에 보관한다. (절대 vortexing하지 말 것!!)

 

6) 150㎕의 차가운 solutionⅢ를 넣고 살짝 섞어준 뒤 얼음에 3-5분 정도 보관한다.

 

7) 원심분리(12,000rpm for 10min)하여 DNA solution과 cell debris를 분리시킨 다. (처음에는 액체만 따고, 다음에는 까만 것만 딴다. DNA는 위에 것임을 주의)

 

8) 상층액(DNA solution)만을 조심스럽게 새로운 tube로 옮긴다.

 

9) 상층액의 2배 양의 ethanol을 넣어 vortex로 섞어주고 상온에서 2분 둔다.

 

10) 원심분리(12,000rpm for 5min)한다.

 

11) 상층액을 조심스럽게 쏟아 버리고 상온에서 침전물을 건조시킨다.

 

12) 건조된 침전물에 차가운 1㎖ ethanol(70%)를 넣고 원심분리(12,000rpm for 5min)하여 침전물을 씻어준다.

 

13) 상층액을 조심스럽게 쏟아 버리고 뚜껑을 열어 둔 채로 실온에서 5-10분간 침전물을 건조시킨다.

 

14) 건조된 침전물에 20㎕ TE(pH 8.0)를 넣고 조심스럽게 vortex하여 완전히 녹인다.

 

15) solution를 -20℃에 보관한다.

 

 

 

[일반생물학실험] Mini preparation 레포트