일반생물학실험 | 제한효소반응과 전기영동

 

 

 

본 실험의 주제는 제한효소반응과 전기영동이다. 유전자 클로닝과 유전공학은 특정 염기서열을 인지하고 절단하는 제한효소(restriction enzyme)의 발견에 의해서 가능하게 되었다. 자연에서 이러한 효소들은 파지 혹은 다른 생명체의 DNA가 박테리아 세포 내로 들어오는 것을 막아준다. 그들은 제한(restriction)이라고 불리는 과정으로 외부 DNA를 절단하는 역할을 한다.

 

각각의 제한효소는 제한효소자리(restriction site, 일반적으로 4～8개 염기서열)라는 특정 염기서열을 인지하고 DNA 두 가닥을 자른다. 박테리아는 제한효소자리에 있는 아데닌이나 시토신에 메틸기(-CH₃)를 첨가함으로써 제한효소로부터 자신의 DNA를 보호한다. 제한효소는 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제(핵산분해효소의 하나)로서 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소이다. 제한효소는 그 특성(절단양식이나 활성발현인자 등)에 의해 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ형의 3군으로 구분된다.

 

Ⅰ형 효소는 활성발현에 ATP, S-아데노실메티오닌 및 마그네슘이온(Mg²⁺)을 필요로 하고, DNA 속의 인식염기배열로부터 떨어진 부위를 절단하는데 그 위치는 일정하지 않다.

 

Ⅱ형 효소는 유전공학에서 널리 사용되는 것으로 활성발현에 마그네슘이온을 필요로 하여 DNA분자의 특정한 염기배열을 인식하고 그 부위 또는 인식염기배열로부터 일정 염기 떨어진 인접부위를 정확하게 절단한다. 또 이 효소의 인식염기배열은 3～6개의 2회전 대칭구조를 취하고 있는 경우가 많다. 인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소이므로 분자생물학 연구에 아주 유용하게 이용되고 있다. 실험에 쓰이는 제한효소는 특별한 말이 없는 한 Ⅱ형 효소를 말한다.

 

대부분의 Ⅱ형 효소 제한효소는 4개, 5개, 또는 6개의 염기서열을 인식하는데, 이에 따라 DNA 상에 인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다. 즉 6개의 염기서열을 인식한다면 이론상 46=4096base pair마다 한번씩 출현하게 된다. 제한효소가 인식할 수 있는 부위는 palindrome, 즉 앞으로 읽으나 뒤로 읽으나 염기서열이 같은 모양을 하고 있는 것이 특징이다. 잘린 후의 DNA 모양은 sticky end(5'-overhang cohesive end, 3'-overhang cohesive end) 또는 blunt end가 만들어질 수 있으므로 목적에 따라서 잘 선택해서 사용해야 한다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 다음과 같이 reaction mixture를 준비한 후, 37℃(pre-set) water bath에서 30분간 incubation시킨 후, 반응이 진행되는 동안 1% agarose gel(w/v)를 준비하였다.

 

2) 100㎖의 1x TAE에 1g agarose를 넣고 전자레인지로 2분간 heating하고 식혔다.

 

3) 위에서 준비된 1% agarose gel (100㎖)에 1㎕의 EtBr을 넣어주고, 고르게 섞이도록 살짝 흔들어 주었다. gel cast에 comb를 꼽은 후, gel을 조심스럽게 붓고 20～30분간 굳혔다.

 

4) electrophoresis chamber를 준비하고, 1x TAE running buffer를 표시선까지 부었다.

 

5) 30분간 incubation이 끝난 sample에 2㎕의 6x loading dye를 넣고, 잘 섞었다.

 

6) 굳은 gel을 조심스럽게 1x TAE buffer가 담긴 chamber에 넣고 soaking하였다.

 

7) 각 sample을 각 well에 조심스럽게 loading하였다. 동시에 1kb DNA marker(4㎕)도 함께 loading하였다. (각 sample이 다른 well로 넘어가지 않게 주의하면서 pipetting한다)

 

8) 100V에서 down dye가 3/4에서 4/5부근에 도달할 때까지 running(대략 30～40분)하였다. running이 끝난 gel은 portable UV lamp를 사용하여 DNA bands를 확인하거나, gel doc을 사용하여 image file을 얻었다.

 

9) plasmid map을 근거로 electrophoresis를 통해서 각 sample에서 나타날 수 있는 DNA band size를 예상해보았다.

 

 

 

[일반생물학실험]제한효소반응과 전기영동 레포트