일반생물학실험 | cDNA 합성 및 Real-time PCR을 통한 유전자 발현 분석

 

 

 

TIP

 

 

1. 세포들은 기본적으로 주위 환경에 적응하기 위해 필요한 유전자의 발현을 증가시키고, 필요 없는 유전자의 발현은 억제시키는 방법으로 유전자 발현을 조절한다.
2. 동일한 세포를 서로 다른 영양 환경의 배지에서 배양한 후 유전자 발현을 비교하기 위해 cDNA를 합성하고, Real-time PCR을 통해 유전자 발현의 차이를 직접 확인해 보고자 한다.

 

 

 

cDNA는 mRNA를 역전사 시켜 만든 DNA 염기서열로, exon만 존재하는 성숙 mRNA에 상보적인 DNA이다. cDNA를 통해 발현된 DNA 염기서열이 무엇인지 파악할 수 있다. Real-time PCR은 PCR 과정이 진행됨과 동시에 증폭되는 DNA 표적서열의 양을 측정하는 실험방법이다. PCR은 중합효소연쇄반응으로, DNA의 표적서열을 선택적으로 증폭시키는 기술이다.

 

PCR에는 증폭시키고자 하는 특정 염기서열에 맞는 두 종류의 프라이머와 dNTP, Taq DNA 중합효소 등이 필요하며, DNA denaturation(95℃), annealing(60℃), DNA extension(72℃)의 단계를 거쳐 DNA의 표적서열을 증폭시키게 된다. 한편, Real-time PCR은 PCR이 진행됨과 동시에 DNA 표적서열의 양이 측정되는 기술로서, 측정된 DNA 표적서열의 양은 컴퓨터에 자동으로 기록되어 확인할 수 있다. 참고로 증폭된 DNA 표적서열의 양은 SYBR Green이라는 형광물질을 통해 측정되는데, 이 SYBR Green 형광물질은 이중가닥 사이에만 끼어들게 되어 증폭이 완료된 DNA 표적서열의 양만 측정할 수 있게 한다.

 

5′-AGCTTAAGCCTGGTA-3′

3′-TCGAATTCGGACCAT-5′

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실험 방법

1. cDNA 합성

1) 1.5㎖ micro tube에 RNA(Ra) 혹은 RNA (Gal) 8㎕, dNTP 1㎕, RT primer 1㎕를 첨가한다. (total 용액 10㎕)

 

2) 1)과정을 마친 micro tube를 vortexing 하고, 원심분리기를 이용해 centrifuge 한다.

 

3) 2)과정을 마친 micro tube를 heating block 65℃에서 5분간 방치한다. → RNA denaturation 과정

 

4) 3)과정을 마친 micro tube에 cDNA synthesis mix{RTase, RNase inhibitor, buffer} 10㎕를 첨가한다.

 

5) 4)과정을 마친 micro tube를 vortexing 하고, 원심분리기를 이용해 centrifuge 한다.

 

6) 5)과정을 마친 micro tube를 heating block 50℃에서 30분간 방치한다. → cDNA 합성 과정

 

7) 6)과정을 마친 micro tube를 heating block 95℃에서 5분간 방치한다. → cDNA 합성 종료 과정(RTase inactivation)

 

8) 합성한 cDNA를 1/25로 dilution하기 위해 새로운 1.5㎖ micro tube에 7)과정을 마친 cDNA 2㎕와 TDW 48㎕를 첨가한다. (total 용액 50㎕)

 

9) 다음 수업시간 (Real-time PCR)까지 1/25 dilution된 cDNA를 보관한다.

 

2. Real-time PCR

1) SYBR Green + dNTP + DNA polymerase + buffer 혼합용액 20㎕이 담긴 1.5㎖ micro tube에 primer(SCR1 or TKL2) 4㎕, DNA template(1/25로 dilution된 cDNA – Gal or Ra) 2㎕, TDW 14㎕를 첨가한다. (total 용액 40㎕; primer와 DNA template의 종류에 따라 총 4개의 40㎕용액이 만들어짐)

 

2) 1) 과정을 마친 1.5㎖ micro tube를 vortexing하고 centrifuge 한다.

 

3) 96 well plate에 2)과정을 마친 용액을 10㎕씩 총 3 copy loading 한다. (즉, ①에서 만든 용액 40㎕ 중 30㎕를 loading 한다. 10㎕는 여유분이다.) 이 때, 96 well plate의 A행 10,11,12 열에는 SCR1-Ra 용액을, B행 10,11,12 열에는 SCR1-Gal 용액을, C행 10,11,12 열에는 TKL2-Ra 용액을, D행 10,11,12 열에는 TKL2-Gal 용액을 각각 loading 한다.

 

4) 96 well plate 위에 seals(투명 film)를 붙여주고 centrifuge 한다.

 

5) 4)과정을 완료한 96 well plate를 Real-time PCR 장치에 넣고, 작동시킨다.

 

6) 1시간 30분 후에 결과를 관찰한다.

 

 

 

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